不同部位驴肉风味物质差异分析

李秀，杨燕，DAUDA SA-ADU ABIOLA，成向荣，梅娜娜，王东亮*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)2(国家胶类中药工程技术研究中心，东阿阿胶股份有限公司，山东 东阿，252201)

自古人们对驴肉风味已有基本的感性认识，素有“天上龙肉，地下驴肉”之说，驴肉有益于人体健康，比如补气血、补肾、利肺等作用，特别是对止烦、安神清脑有显著效果[1]。现代驴肉营养成分的分析结果表明，驴肉具有较高的营养价值，具有“三高三低”的特点：高蛋白，高必需氨基酸，高必需脂肪酸；低脂肪，低胆固醇，低热量[2-3]。但由于早期驴主要作为交通运输和农业役用家畜，且饲养和食用具有区域具有很强的地域性，主要集中在西北等欠发达地区，因此极大制约了驴肉及其制品的开发及市场的发展。目前对驴肉的研究主要集中在其脂肪酸组成和功能评价以及驴肉产品开发[4]，关于驴肉风味的研究较少，对形成驴肉特有香味、滋味的化学物质基础尚未明确，尚缺乏比较不同部分驴肉风味差异的研究。而目前人民生活水平日益提高，从之前的温饱型结构已经转变到营养型结构。越来越多的人们青睐驴肉及其制品，因此对驴肉风味研究迫在眉睫。

风味是评定肉品品质的重要指标之一，其是由产生气味的挥发性成分和产生滋味的非挥发性物质构成[5-6]。基于风味特征成分的复杂性与微量性，本文先使用电子鼻评估4个部位驴肉的香气特征，后利用SPME技术富集挥发性风味物质，并利用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法进行组分分析，研究不同部位驴肉挥发性风味物质组成与特点，并使用高效液相色谱仪和氨基酸分析仪对驴肉中形成滋味的呈味核苷酸和游离氨基酸进行测定和评价。应用多种分析方法对不同部位驴肉的风味物质进行鉴定，找出体现驴肉风味差异的主要物质，建立风味组分与感官联系，以期为驴肉风味物质研究提供理论基础，为推动驴肉及其制品的深开发和驴肉资源利用提供基础，并为后期实际生产提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驴肉，由山东东阿阿胶股份有限公司提供；将原料按颈、脊、肋、腿4个部位进行分割、分装、放入80 ℃ 的恒温水浴锅，煮30 min，冷却至室温，密封待测。二氯苯(分析纯AR)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；HClO4、KOH(分析纯AR)，上海沪试实验室器材股份有限公司；次黄嘌呤、肌苷酸、鸟苷酸、腺苷酸、肌苷,美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

科学AR224CN电子天平，奥豪斯仪器有限公司(中国)；HeraclesII快速气相色谱电子鼻，Alpha MOS S.A.有限公司(法国)；TSQ Quantum XLS三重四级杆气质联用仪，赛默飞世尔科技有限公司(美国)；Shimadzu LC20A高效液相色谱分析，岛津(日本)；L-8900 高速氨基酸分析仪，日本株式会社日立高新技术科学那珂事业所(日本)；HH-3A数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司(中国)；5804R离心机，Eppendorf艾本德(德国)；OHAUS pH计、20 mL顶空瓶，Agilent科技公司(美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 HeraclesⅡ快速气相电子鼻

把颈、脊、肋、腿4个部位的驴肉分别搅碎，各样品分别称取5.000 g于20 mL的顶空瓶中，加盖密封，每组设置5个平行样品。参考陈修红等[7]的研究方法，设置好检测程序之后直接开始检测分析样品。

2根不同极性的色谱柱的参数分别为：DB-5-FID1和DB-1701-FID2，柱长2 m，柱内径1 mm，程序升温速度10 ℃/s，于20 mL顶空瓶中放入5.0 g的样品，仪器进样体积2 000 μL，进样速度125 μL/s，进样口温度200 ℃；搜捕井初始温度50 ℃，持续时间18 s； 检测器温度260 ℃。

1.3.2 SPME-GC-MS检测

称取1.80 mg的1,4-二氯苯，用高纯水定容至100mL容量瓶中，配制成质量浓度为0.018 g/L的1,4- 二氯苯溶液，作为内标物溶液进行后续实验的分析。

参考徐微微等[8]研究方法，并适当进行调整。顶空固相萃取条件：萃取头型号50/30 μm DVB/CAR/PDMS；萃取头经过250 ℃、30 min老化后，于80℃加热托盘中，恒温顶空萃取50 min；结束萃取后，将萃取头的针头拔出后立即插入到GC进样口，2 min解析完成本次试验的检测。

气相色谱-质谱条件：DB-5毛细管柱(Agilent J&W GC，30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；柱初温40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升温到240 ℃，保持5 min；载气为99.999%高纯He，流量1.0 mL/min；不分流模式进样。

质谱条件：传输线和离子源温度240 ℃；扫描范围35～500 m/z；电离电压70 eV。

1.3.3 呈味核苷酸的分析方法

参考DAI等[9]的方法并作适当修改。称取适量的标准品使用高纯水进行配制成浓度1 000 μmol/L母液，并按梯度稀释为100、40、20、10、5 μmol/L，进样量为20 μL，根据溶液在标准品内保留时间定性，将测得的峰面积作为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线见表1。

取样品在绞肉机中充分搅碎混匀，称取约5 g于50 mL离心管中，加入预冷的50 g/L高氯酸盐15 mL，用高速匀浆器完全均匀化后，用冷冻离心机10 000 r/min离心5 min。上清液转移至100 mL烧杯，加入预冷的50 g/L高氯酸15 mL，摇匀，将上清液再离心、混合，重复上述操作2次。将上清液pH调至6.5，高纯水定容至50 mL容量瓶中。滤液经0.45 μm微孔膜过滤，用于高效液相色谱分析。

色谱柱：Galaksil EF-C18Bio；流动相：A：0.05 mol/L NaH2PO4-水，B：甲醇，SPD-20A紫外检测器检测波长：260 nm，进样量20 μL。

液相条件： 0～6 min,0%甲醇；6～7 min,0%～5%甲醇；7～16 min,5%甲醇；16～17 min,100%甲醇；17～30 min，100%甲醇。

混合标准品溶液的HPLC图谱(图1)，在驴肉样品中每一个单独的标准品的出峰顺序和保留时间依次为:鸟苷酸(5′-GMP)，4.939 min；肌苷酸(5′-IMP)，5.344 min；次黄嘌呤(Hx)，6.513 min；腺苷酸(AMP)，8.804 min；肌苷(HxR)，15.579 min。对梯度浓度的核苷酸标准品进行分析，建立5种核苷酸的标准曲线如表1所示，标准曲线性关系良好(图1)。

图1 核苷酸混合标准品溶液的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of nucleotide mixed standard solution

表1 5种核苷酸的定量标准曲线Table 1 Quantitative standard curve of 5 nucleotides

呈味核苷酸 线性回归方程R25'-GMPY=12 636x+4 211.50.999 95'-IMPY=8 147.3x-4 717.90.999 9HxY=9 825.1x+31 4430.995 8AMPY=15 176x-3 953.70.999 9HxRY=8 825.4x+2 353.60.999 9

鲜味核苷酸含量计算方法：基于拟合的标准曲线和如下公式(1)求得：

X=C×V×m[10]

(1)

式中：X,检测目标物质的含量mg/100g；C,目标物质的浓度，mg/mL；V,样品的体积，mL；m,样品称量质量，g。

滋味活性值(TAV)计算方法如公式(2)：

(2)

式中：C,所测滋味物质的质量；T,所测物质的气味阈值。

1.3.4 游离氨基酸的分析方法

取适量待测样品在绞肉机中充分搅碎混匀，准确称取5.0 g置于离心管中，加入30 mL高纯水，高速均质后超声分散30 min，离心，将上清液转移到50 mL的容量瓶中，用高纯水定容，经0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。

参考KOBAYASHI等[12]方法进行分析，分析柱为Na型离子交换色谱柱(4.6 mm×60 nm, 3 μm),以锂盐缓冲液为洗脱液，双通道检测，流速分别为 0.45、0.35 mL/min，检测波长分别为420、570 nm，柱温为57 ℃， 柱后衍生，衍生剂为茚三酮缓冲液，反应温度135 ℃。

2 结果与分析

2.1 不同部位驴肉电子鼻分析

HeracleⅡ快速气相电子鼻运用2根不同极性色谱柱同时进行分离经FID检测器检测，主要通过主成分分析(PCA)对样品的原始数据向量进行线性转换，通过改变坐标轴来达到区分样品的目的并根据保留指数指定库对样品的风味进行分析并找出可能的差异物质。

主成分分析是由PCA的贡献率决定的，从PCA的二维图来看，样品在横、纵坐标单向距离代表了样品间差异性的大小；如果2个样品单向的横向距离越大，表明样品间存在大差异，反之则小；由于纵向距离对于样品间贡献率小，所以对样品间差异性影响也较小[13]。据田怀香等的研究[14]，70%～85%的总体贡献率可以进行实验检测。由图2得知，PC1、PC2和两累加的方差贡献率分别为68.33%，23.67%和92.00%，驴腿肉与其他3部位驴肉在横坐标上的水平距离较远，肋、颈、脊肉在横坐标上的水平距离较近说明驴腿肉与另外3个部位驴肉存在明显的挥发性风味差异。

1-驴腿肉；2-驴肋肉；3-驴脊肉；4-驴颈肉图2 不同部位驴肉的电子鼻PCA图Fig.2 The PCA image of electronic nose analyse for different parts of donkey meat

由图3可知，在2根色谱柱的对应下，找出不同部位驴肉的风味存在差异性的保留时间，初步了解不同部位驴肉所存在的差异性物质。实验进一步对差异性化合物进行定性分析，采用仪器自带的AroChemBase数据库进行比对，结果显示可能的风味化合物如表2所示。

图3 不同部位驴肉的电子鼻Bar图Fig.3 The bar image of electronic nose analyse for different parts of donkey meat

表2 不同部位驴肉可能的风味差异成分信息Table 2 Different composition in different parts of donkey meat

名称RI DB-5-FID1RI DB-1701-FID2 气味信息乙醛439491刺激性的辛辣气戊醛699780特殊香气甲苯773825刺激性芳香气正己醛802895青草气[15]

2.2 不同部位驴肉GC-MS分析

为了对电子鼻分析中的数据进行验证和分析其他挥发性成分的组成对不同部位驴肉进行GC-MS分析。如表3和图4所示，4个部位驴肉中共检出53种挥发性物质，分别占总颈、脊、肋、腿部位总检出物质的91.92%、92.17%、89.5%、94.78%；其中硅氧烷类物质5种，其可能是固相微萃取头上脱附的复合材料，内标物质有1种(1,4-二氯苯)，农药残留物质1种 (氯唑磷)；有效风味物质46种，其中烃类化合物8种、 醇类化合物10种、醛类化合物19种、脂类化合物5种、酮类化合物1种、呋喃类化合物1种、酸类化合物1种，其他类化合物3种，分别占总颈、脊、肋、腿部位总检出物质的14.02%、22.14%、43.96%、67.81%，该结果与电子鼻数据分析显示，驴腿肉挥发性风味物质最丰富；肋部次之，脊部与颈部最少，含量相近，与这一结果一致。进一步分析如表2～表4所示，在驴肉中挥发性风味物质主要以醛类为主，在颈、脊、肋、腿部中，醛类分别占76.39%、79.63%、82.07%、76.64%。在19种检出的醛类物质中，具有清香和青草味的正己醛含量最高，占总醛类成分的56.6%～70.56%。

表3 不同部位驴肉的53种挥发性风味成分Table 3 The 53 volatile flavor components of cooked donkey meat

图4 不同部位驴肉挥发性成分的GC-MS离子流图Fig.4 Ion chromatogram of volatile flavor compounds in different parts of donkey meat

正己醛的高含量与正己醛合成途径的多样性有关，在油酸、亚油酸和花生四烯酸氧化过程中产生的氢过氧化物都可以分解为正己醛，一些不饱和的醛类物质如2,4-二癸烯醛也可以被裂解形成为正己醛[16]。这与尤娟等[4]研究驴肉脂肪和脂肪酸组成特点中表明，驴肉中不饱和脂肪酸含量(55.8%)丰富，亚油酸(10.1%)和花生四烯酸(2.0%)含量丰富这一结果相一致。本实验中也检测到其他的醛类物质，如庚醛、辛醛、壬醛和一些小分子醛类，它们都是不饱和脂肪酸的氧化产物，庚醛来源于亚油酸的氧化分解，辛醛来源于亚麻酸的氧化分解，壬醛来源于花生四烯酸的氧化分解；但是风味性醛类物质都是来自不饱和醛，在氧化降解为短链的醛类[17-19]，这与文献研究表明挥发性气味主要来源于肉在受热过程中所产生的不饱和醛酮等有关相一致[20]。

结合不同部位熟驴肉挥发性风味物质的快速电子鼻和GC-MS分析结果，通过成分比对验证，进一步确认了影响驴颈、脊、肋、腿肉风味差异的主要风味成分为正己醛。根据内标化合物1,4-二氯苯的浓度，计算驴肉颈、脊、肋、腿的正己醛含量分别为4.85×10-3，2.024×10-2， 1.572×10-2，4.653×10-2mg/100 g，均远远高于正己醛的风味阈值0.45×10-3mg/100 g，进一步表明，正己醛是影响驴肉风味的重要挥发性风味成分。

驴肉中测得醛类化合物含量高不仅由于其在相对含量上有绝对优势，而且其香气阈值比较低，在脂质氧化过程中形成速度快，对风味有重要影响。碳链的长度和化合物的味道存在一定的规律性，随着碳原子数的增加，相应的醛类化合物会呈现出不同的风味，含3～4个碳原子的醛具有强烈的刺激性气味，5～9个碳原子的醛表现出芳香、油香，大多数的醛都有一种清新芳香的气味，具有较大分子质量的醛具有橙皮的风味[21]。除了醛本身对风味的贡献之外，它们还可以产生羰氨反应来产生香气前体(表4)。

2.3 不同部位驴肉呈味核苷酸分析

驴肉风味中的非挥发性成分主要是核苷酸和氨基酸，其中呈味核苷酸是肉类食品很重要的呈鲜味物质。最具代表性的呈味核苷酸是5′-GMP和5′-IMP。

表4 不同部位驴肉中各类挥发性风味物质 占有效风味物质的比例Table 4 The proportion of various volatile flavor substances in different parts of cooked meat

注：同行上标有相同字母表示差异不显著(P≥0.05)，上标均不同者表示差异显著(P<0.05)。

两者的含量可以间接体现驴肉味道和口感。肉的成熟分为4个阶段：糖原酵解、死后僵直、僵直解除的成熟。在动物死后的初期，糖原在一系列酶的作用下，降解产生乳酸并堆积在体内，使肌肉的pH降低以及肌肉中ATP分解，在ATP降解过程中会产生腺苷酸、5′-肌苷酸、次黄嘌呤、腺苷二磷酸、肌苷、核糖[22]；宰后动物的肌肉会产生肌苷酸以及相应核苷酸降解产物，肌苷酸降解为次黄嘌呤就会影响驴肉的味道，驴肉苦味增加与肌苷在其中的含量升高有关；所以本试验用高效液相色谱法对4个部位驴肉次黄嘌呤、肌苷、肌苷酸、腺苷酸和鸟苷酸含量进行分析(图5)。

图5 不同驴肉的呈味核苷酸含量Fig.5 The taste nucleotide content of cooked donkey meat in 4 parts

由图5可以看出，4个部位熟驴肉中呈味核苷酸以5′-IMP和HxR为主，而5′-GMP、AMP、Hx含量相对较低。畜禽类动物屠宰、冷却成熟后，ATP依次分解为ADP、AMP、IMP、HxR、Hx，驴肉中5′-IMP含量较高，说明AMP分解主要产生5′-IMP，且累积速度远大于其分解速度。比较不同部位熟驴肉的呈味核苷酸总含量，腿部>肋部>颈部>脊部，表明腿、肋部的滋味比颈、脊部鲜美。

5′-GMP和5′-IMP是最具代表性的呈鲜味核苷酸，其风味阈值分别为12.50，25.00 mg/100g，计算不同部位驴肉滋味活度值(TAV)，其结果如表5所示。TAV值>1，表明该核苷酸的滋味能被人们感知，而<1时则不被人们感知[23]。驴肉中5′-GMP的TAV值均<1，因此5′-IMP是驴腿、肋、颈肉的主要呈味核苷酸，HxR是驴脊肉的主要呈味核苷酸。不同部位驴肉的风味特点，提出其适用于不同的加工方式以提升或保留其鲜香味，更有利于驴肉在加工生产方面开发新的方向(表5)。

表5 不同部位驴肉中5′-GMP和5′-IMP的TAV值Table 5 TAV values of 5′-GMP and 5′-IMP in the different parts of cooked meat

注：同列上标有相同字母表示差异不显著(P≥0.05)，上标均不同者表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.4 不同部位驴肉呈味氨基酸分析

由表6可以看出，驴肉中主要氨基酸有精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)和甘氨酸(Gly)，它们呈现的氨基酸含量较丰富。驴肉中氨基酸总量中驴腿>驴颈>驴脊>驴肋，分别为140.33、126.65、105.20、104.33 mg/100 g。腿、颈部游离氨基酸含量相对较高，可能腿、颈部位的滋味更鲜美。

决定食物蛋白质营养价值高低的因素为必需氨基酸的含量、种类和其比例。不同部位驴肉的检测结果表明，必需氨基酸都被检测出，这也在一定程度上说明驴肉的营养丰富[24]。氨基酸类的化合物在肉类食品中都是呈现风味的物质。天冬酰胺(Asn)、组氨酸(His)、脯氨酸(Pro)是肉中的主要呈酸味的氨基酸；丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)和苏氨酸(Thr)是主要呈甜鲜味的氨基酸；谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是主要呈鲜味氨基酸；甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)是主要呈苦味氨基酸。所以，可能会影响其味道的是谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量。风味物质主要通过疏水相互作用与水合蛋白质相结合，任何影响疏水作用或蛋白质表面疏水性的因素都会影响风味结合，具有强疏水性的氨基酸味道更苦，反过来就是甜味更重[25]。

表6 不同部位驴肉中呈味氨基酸的含量 单位：mg/100g

注：NEAA表示非必需氨基酸，EAA表示必需氨基酸，TAA表示总氨基酸。

表7显示，呈甜味的氨基酸在驴肉的各部位中含量最高，其次为呈苦味的氨基酸和呈鲜味的氨基酸。在驴肉不同部位氨基酸数据对比中发现，驴颈部的呈味氨基酸含量最高，预示着驴颈肉可能风味最好。

表7 不同部位驴肉中呈味氨基酸含量及 占氨基酸总量的百分比Table 7 Content of amino acids in the different parts of cooked meat and percentage of total amino acids

3 结论

通过电子鼻和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析，驴腿由较其他3个部位所含有的形成气味的挥发性物质较多以青草味的正己醛为主，而肋、脊、颈三者的差异不明显；但是在呈味氨基酸结果中发现，驴颈肉呈味氨基酸含量最高，所以在呈味氨基酸中驴颈肉可能是呈现滋味最好的部位；在呈味核苷酸检测中发现，驴腿部和驴肋部含量高于驴颈部和驴脊部；综上所述，驴腿肉具有较重的风味气味，而驴颈肉滋味更鲜美，味道和口感更佳，是生产和加工工艺上选择的最佳部位。并确定出醛类物质是影响驴肉挥发性风味的主要物质，且正己醛是影响驴肉风味最关键的挥发性成分。