顺铂联合黄芪甲苷对C6胶质瘤小鼠凋亡基因的影响

常笑语 黄可欣 李蕴潜

(1吉林大学第一医院，吉林 长春 130021；2吉林大学基础医学院组织学与胚胎学教研室)

胶质瘤是颅内肿瘤中最常见的恶性肿瘤，发病率占颅内肿瘤首位，预后差、存活率低〔1，2〕。目前治疗胶质瘤的主要手段是手术治疗，但因为胶质瘤呈浸润性生长，手术根除率差，故术后常配合放疗和化疗。顺铂是人工合成的一种含铂类物质的常用化疗药物，能与细胞内的微管蛋白结合，抑制细胞有丝分裂，从而达到抑制癌细胞发展的作用〔3，4〕；黄芪甲苷能抑制肿瘤增殖、侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，增强机体免疫功能〔5〕。因此，本研究将顺铂和黄芪甲苷联合用药，观察联合用药治疗胶质瘤相比顺铂、黄芪甲苷单独用药是否具有优势。

1 材料与方法

1.1实验仪器与试剂 Epoch酶标仪(美国)、PCR扩增仪(美国)、实时荧光定量仪(美国)。顺铂，山东齐鲁制药有限公司，国药准字H20073652；小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；DMEM营养液(美国Gibco公司)；黄芪甲苷，南京泽朗医药科技有限公司，批号ZL1303325YY；BALB/c 小鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3酶联免疫试剂盒由长春鼎国生物有限公司提供；Trizol、引物、RT-PCR试剂盒由上海生物工程有限公司提供。

1.2动物分组和模型制备 BALB/c小鼠40只，体重20～22 g。随机分为肿瘤对照组、顺铂组、黄芪甲苷组、联合用药组(联合应用顺铂及黄芪甲苷)，每组10只。制备2×106个/20 μl的C6胶质瘤细胞悬液，接种于小鼠右前肢腋窝皮下，约7 d待肿瘤长至50～70 mm3时，给予治疗。

1.3药物配制和给药方法 顺铂2 mg/kg(配制成2 ml/200 g)，腹腔注射1次/3 d；黄芪甲苷12 g/kg(配制成1 ml/200 g)，灌胃1次/d；连续治疗21 d。

1.4标本采集 实验结束次日处死动物，眼球取血分离血清(3 000 r/min，10 min)，剪下肿瘤组织，-80℃保存待测。

1.5检测指标

1.5.1各组Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量检测 肿瘤组织悬液制备，按重量(g)∶体积(ml)=1∶9的比例，2 500 r/min离心10 min取上清液。血清和肿瘤组织上清液检测均采用双抗体夹心法，设定空白孔、标准孔和待测样品孔，严格按照试剂盒流程操作。

1.5.2各组Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA水平检测 Trizol提取血清和肿瘤组织RNA，每个样本基因扩增3次，行实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平。

1.6统计学方法 采用SPSS16.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组血清中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比较 与肿瘤对照组比较，黄芪甲苷组、顺铂组、联合用药组血清中Bcl-2、Survivin蛋白含量和mRNA水平均明显依次降低，Bax、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平均明显依次升高，组间差异均有统计学意义(P<0.05)，联合用药组作用尤为显著，见表1。

2.2各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比较 与肿瘤对照组比较，黄芪甲苷组、顺铂组、联合用药组肿瘤组织中Bcl-2、Survivin蛋白含量和mRNA水平均明显依次降低，Bax、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平均明显依次升高，组间差异均有统计学意义(P<0.05)，联合用药组作用尤为显著，见表2。

表1 各组血清中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比较

与肿瘤对照组比较：1)P<0.05；与联合用药组比较：2)P<0.05；与顺铂组比较：3)P<0.05；下表同

表2 各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白含量和mRNA水平比较

3 讨 论

肿瘤是大量肿瘤细胞聚集形成的异物肿块，其中恶性肿瘤因其复杂难治愈被列为世界五大疑难杂症之一，目前治疗恶性肿瘤的主要手段是手术治疗及术后配合放疗和化疗〔2，5〕。胶质瘤对放疗的敏感度低，多数术后采用化疗辅助，化疗药物有多种，如阿霉素、紫杉醇、替莫唑胺及顺铂等。长期或者大量使用化疗药物会对机体产生心脏、肝脏、肾脏等方面的毒性作用。因此，寻找抗耐药性、提高抗肿瘤作用及降低脏器毒性损伤的药物尤为重要〔2，6〕。

Bcl-2、Survivin是抑制凋亡基因，Bcl-2参与组织发育，细胞自噬、迁移、凋亡及骨架形成等，通过调节线粒体外膜通透性和钙信号调控凋亡〔7,8〕；Survivin是目前发现分子量最小的抑凋亡基因，它能促进细胞有丝分裂，在细胞增殖、细胞周期、染色体移动中发挥重要作用，在胚胎组织外的正常组织中基本不表达〔9,10〕。Bax、Caspase-3都是促进凋亡基因，Bax定位于人染色体19q13上，当受凋亡信号刺激时Bax从细胞质转移到线粒体，和Bcl-2结合发挥促凋亡作用〔11,12〕；Caspase-3能降解多种蛋白底物、阻滞细胞周期、裂解细胞结构、破坏机体平衡状态和修复机制，受Survivin的直接或间接抑制，还能降解Bcl-2发挥促凋亡作用〔11～13〕。

以往研究〔1，4〕表明，纳米载药、化疗药物联合用药提高抗肿瘤作用和抗耐药性作用显著，其作用机制是靶向治疗和药物互补。顺铂是人工合成的一类金属化疗药物，它与细胞内的微管蛋白结合，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，从而抑制肿瘤细胞增殖〔2〕；黄芪甲苷具有增效减毒的作用，被广泛应用于癌症的术后治疗及康复〔5，14,15〕。本研究结果显示，黄芪甲苷与顺铂联合用药作用明显优于单独用药，为黄芪甲苷在肿瘤化疗中的推广奠定了实验基础。