肺抑瘤膏对Lewis肺癌种植瘤PI3K/AKT通路的影响

彭召云 郑心 李龙祥 李士涛

(山东中医药大学 1第二附属医院呼吸科，山东 济南 250001；2康复学院；3济南市中心医院功能检查科)

肺癌又称原发性支气管肺癌，发病率及死亡率逐年增高〔1〕。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌发病率的86.3%〔2〕，放化疗治疗有诸多的不良反应及局限性〔3，4〕，近年来中医学在肿瘤领域的治疗中取得了显著成效。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路在肿瘤细胞的生长、存活、增殖、凋亡、血管生成等过程中具有重要作用〔5〕。研究发现，PI3K/AKT信号通路贯穿于NSCLC的发生发展过程，活化的PI3K/AKT通路通过激活下游多种信号转导而促进肿瘤进展〔6〕。研究发现中药可有效抑制PI3K/AKT信号转导通路的AKT位点，促进肺癌细胞的凋亡〔7〕。本实验根据前期研究〔8～10〕复制Lewis肺癌小鼠模型，以化疗药顺铂作对照，采用免疫印迹法、免疫组化检测PI3K/AKT信号通路蛋白，探讨肺抑瘤膏抑瘤的作用机制。

1 材料及方法

1.1材料及用药 瘤株来源：Lewis肺癌荷瘤雄性小鼠2只购于国家实验细胞资源共享平台，荷瘤传3代后进行实验。实验小鼠：C57BL/6近交系雄性小鼠(许可证号SCXK(鲁)20140007)，6～8周龄，体重(18±2)g。AKT抗体(CST#4691)、PI3K抗体(CST#4257)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR，CST#2983)、通用型SP检测试剂盒#SP-9000 WK152108(中杉金桥)；十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)配制试剂盒#P0012A(碧云天生物技术)。肺抑瘤膏(1 ml膏方相当于生药量4.3 g)由山东中医药大学第二附属医院药剂科按照膏方制备工艺流程制备，分装保存备用。注射用顺铂：规格20 mg，齐鲁制药有限公司，产品批号：1WA2A15040258。

1.2造模方法 将C57BL/6荷瘤小鼠采用脱颈椎法处死，酒精消毒，在超净工作台上用已灭菌的剪刀、镊子完整剥离肿瘤组织，于冰上研磨并制备细胞悬浊液，离心计数后调整细胞浓度为1.0×107/ml，在小鼠腋窝下接种肿瘤细胞悬液0.2 ml/只(约含瘤细胞2.0×106个)。注射后见小鼠腋窝处形成一圆形透明水泡即为成功〔11〕。

1.3分组及给药 当能用游标卡尺在小鼠腋下测到瘤体时，按照SPSS统计软件随机分为模型组、肺抑瘤膏低剂量组、肺抑瘤膏中剂量组、肺抑瘤膏高剂量组、顺铂组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组共6组，12只/组。参照徐叔云等〔12〕主编的《药理实验方法学》第三版，中药给药剂量相当于60 kg成年人按公斤/体重折算剂量的等效剂量。各组给药如下：每天灌胃给予模型组0.2 ml生理盐水，肺抑瘤膏低剂量组予0.2 ml/d生理盐水稀释1倍的肺抑瘤膏，肺抑瘤膏中剂量组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组予0.2 ml/d肺抑瘤膏，肺抑瘤膏高剂量组予0.4 ml/d肺抑瘤膏，连续灌胃3 w。顺铂组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组予顺铂溶液腹腔注射1.5 mg/(kg·d)，连续注射3 d。

1.4瘤重、肿瘤抑制率 末次灌胃结束后禁食水，次日处死存活模型小鼠，迅速剥离模型小鼠腋下瘤体，用滤纸吸干净瘤体周围的血渍后称瘤重。肿瘤抑制率=(模型组平均瘤重-余各组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100%。

1.5Western印迹法检测种植瘤组织中PI3K、AKT蛋白表达 种植瘤组织匀浆、裂解提取总蛋白，分光光度计测定蛋白浓度，取蛋白样品电泳转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭 2 h，PI3K、AKT及β-actin一抗孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜，分别用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 1 h，洗涤后室温显影，凝胶成像系统拍照、封存、计算平均相对表达量。

1.6种植瘤组织病理学观察 剥离模型小鼠种植瘤，迅速固定于10%中性甲醛中，石蜡包埋后切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察Lewis肺癌种植瘤病理组织形态学变化。

1.7免疫组化法检测种植瘤组织中mTOR蛋白表达 石蜡切片常规脱蜡至水，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复，3%过氧化氢(H2O2)去离子水孵育，PBS冲洗，山羊血清工作液封闭室温孵育，滴加mTOR一抗4℃过夜，PBS冲洗，生物素化二抗工作液室温孵育，PBS冲洗，辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育，PBS冲洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水充分冲洗，苏木素轻度复染、脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察，阳性结果为：胞质呈棕黄色颗粒状。HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统计算每张切片阳性细胞占总细胞的百分比含量。

1.8统计学方法 采用 SPSS17.0软件，符合正态分布的，采用方差分析；不符合正态分布的，采用非参数检验。

2 结 果

2.1动物一般情况 肺抑瘤膏高剂量组意外死亡2只，顺铂加肺抑瘤膏中剂量组死亡1只，解剖后发现死因均为灌胃误入气管。

2.2种植成功率 各组接种Lewis肺癌细胞悬液后，1 w内小鼠腋下均可触及肿瘤硬结，用精度为0.01 mm的游标卡尺测量、计算，结果显示瘤体体积均可达到100 mm3左右。种植成功率为100%。

2.3各组瘤重、抑瘤率比较 各剂量肺抑瘤膏组Lewis肺癌模型小鼠种植瘤瘤重均较模型组降低，肺抑瘤膏低剂量组、肺抑瘤膏中剂量组、肺抑瘤膏高剂量组随着肺抑瘤膏浓度的增加其抑瘤率越来越高(P<0.05)。见表1。

表1 各组Lewis肺癌种植瘤瘤重、抑瘤率、PI3K、AKT及mTOR表达

与模型组比较：1)P<0.05；与肺抑瘤膏低剂量组比较：2)P<0.05；与肺抑瘤膏中剂量组比较：3)P<0.05；与肺抑瘤膏高剂量组比较：4)P<0.05；与顺铂组比较：5)P<0.05

2.4各组种植瘤组织病理比较 各组Lewis肺癌模型小鼠种植瘤细胞未见腺体结构，细胞异型性大，属于低分化癌。肺抑瘤膏中剂量组、肺抑瘤膏高剂量组、顺铂组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组均可见坏死肿瘤细胞。见图1。

2.5各组mTOR蛋白表达比较 模型组mTOR表达量最高，除顺铂组外，与其他4组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。肺抑瘤膏低剂量组种植瘤mTOR表达，与肺抑瘤膏中剂量组、肺抑瘤膏高剂量组、顺铂组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；肺抑瘤膏中剂量组mTOR表达与肺抑瘤膏高剂量组、顺铂组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；肺抑瘤膏高剂量组mTOR表达与顺铂组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。顺铂加肺抑瘤膏中剂量组mTOR表达显著低于顺铂组(P<0.05)。见表1、图2。

图2 各组Lewis模型小鼠种植瘤mTOR表达(×400)

2.6各组PI3K、AKT蛋白表达的比较 模型组PI3K、AKT表达量最高，与肺抑瘤膏中剂量组、肺抑瘤膏高剂量组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。各组药物干预均可降低种植瘤PI3K、AKT表达，但肺抑瘤膏低剂量组及顺铂组PI3K、AKT表达量与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。肺抑瘤膏低剂量组PI3K、AKT表达与肺抑瘤膏中剂量组、肺抑瘤膏高剂量组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；肺抑瘤膏中剂量组PI3K、AKT表达与顺铂组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；肺抑瘤膏高剂量组PI3K、AKT表达，与顺铂组及顺铂加肺抑瘤膏中剂量组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图3、图4。

1～6:模型组、肺抑瘤膏低剂量组、肺抑瘤膏中剂量组、肺抑瘤膏高剂量组、顺铂组、顺铂加肺抑瘤膏中剂量组；图4同图3 各组PI3K蛋白表达

图4 各组AKT蛋白表达

3 讨 论

PI3K/AKT信号通路可激活磷酸化mTOR及下游的p70S6K和真核转录起始因子4Z结合蛋白(4E-BPI)的磷酸化而抑制细胞凋亡；上调细胞周期素、细胞周期依赖性蛋白激酶等的翻译，促进周期运行，加速肿瘤细胞增殖和分化；促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达，增加肿瘤细胞血管生成等〔13，14〕。研究〔15〕发现补中益气汤通过抑制A549/DDP 细胞中PI3K的基因，降低AKT磷酸化，使下游因子如Bad、核因子(NF)-κb表达减少及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9表达增多，进而促进A549/DDP细胞的凋亡。研究〔16〕发现肺岩宁方联合吉非替尼可显著抑制H1975肺癌小鼠移植瘤的生长，促进肿瘤细胞凋亡，显著下调p-表皮生长因子受体(EGFR)、p-AKT、p-mTOR水平。其作用机制可能与阻断PI3K/AKT信号通路有关。通过以上文献研究发现，中药可抑制肿瘤细胞PI3K/AKT信号通路蛋白表达，抑制细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，提示中药肺抑瘤膏可能通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥抑瘤作用，本实验从蛋白层面探讨肺抑瘤膏抑制Lewis肺癌模型小鼠种植瘤生长可能的作用机制。

本实验结果提示低、中、高剂量肺抑瘤膏均可减小Lewis肺癌模型小鼠种植瘤瘤重，且随肺抑瘤膏剂量的增加抑瘤率逐渐递增，说明肺抑瘤膏能抑制Lewis肺癌种植瘤生长且与用药剂量相关。PI3K/AKT信号通路蛋白检测结果提示不同剂量肺抑瘤膏均可降低Lewis肺癌模型小鼠种植瘤PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达，说明肺抑瘤膏可抑制PI3K/AKT信号通路蛋白表达。顺铂对PI3K/AKT信号通路蛋白表达影响不明显，可能与顺铂作用于肿瘤细胞后影响了肿瘤细胞内多种信号通路及各信号通路间交叉级联有关，其具体作用机制尚待进一步研究。