酸柏栀油软胶囊对2型糖尿病肾病大鼠的作用

吉金山 张正祥 李宝莉 张欣 曹净 赵隆 王清清 邓飞龙

(延安大学医学院 1预防教研室，陕西 延安 716000；2药理教研室；3 2016级本科生；4 2018级本科生；5 2017级本科生)

慢性肾病(CKD)的存在和严重程度是糖尿病患者不良预后的重要提示因素〔1〕，糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者最常见的并发症之一，也是导致终末期肾病(ESRD)的主要原因，有20%～40%的2型糖尿病患者会发生肾脏疾病〔2〕，我国ESRD中DN患者仅次于肾小球肾炎〔3〕。由于长期的高血糖和糖尿病状态导致肾小球、肾小管或肾间质受损从而引起DN〔4〕，这种肾损伤在早期是可逆的，但一旦肾病变明显，就变得不可逆，最终发展为ESRD〔5〕。因此，早期DN的治疗对于改善糖尿病患者预后具有重要意义。酸柏栀油软胶囊具有很好的降血脂〔6〕、抗氧化作用〔7〕。本研究主要探讨酸柏栀油软胶囊对于DN大鼠的改善作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 60只4周龄雄性SPF级SD大鼠，体重(173.12±4.33)g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，许可证号SCXK(陕)2017-003。

1.2试剂与仪器 酸枣仁油购自陕西旭煌植物科技发展有限公司，柏子油和栀子油由广西山云生化科技有限公司提供。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，使用时以0.1 mol/L pH4.2无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制成浓度为1%的STZ溶液，即用即配。盐酸二甲双胍片(购自延安大学附属医院药房)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)，酶标仪(美国Bio Tek公司)，称量台，血糖检测仪(美国强生公司)，全自动生化分析仪(西门子2400)。

1.3DN模型建立方法 采用高糖高脂饲料联合小剂量STZ法，该法制备的模型具有典型的DN病变特点，主要表现为显著的蛋白尿、肾脏肥大及肾组织细胞外基质积聚明显，适合糖尿病及其并发症的研究〔8〕。所有动物饲养于延安大学医学院实验动物中心，温度22～27℃，湿度45%～55%，12 h交替照明。大鼠自由饮水、进食，每周称量1次体重。适应性喂养3 d后，按体重随机分为正常对照组(10只)和模型组(50只)，正常对照组给予常规饲料喂养，模型组给予高糖高脂饲料(常规饲料66.5%+20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐)〔9〕。喂养6 w后，禁食不禁水12 h，空腹注射STZ 30 mg/kg，正常对照组仅注射等量枸橼酸缓冲液。注射以后随时观察大鼠状态，防止低血糖死亡。72 h后，尾尖采血测空腹血糖，以>16.7 mmol/L即为2型糖尿病模型建立。2 w后用代谢笼收集两组大鼠24 h尿液，检测24 h尿白蛋白，以≥20 mg/24 h即为DN模型制备完成〔10〕。

1.4实验动物分组及干预方法 未造模大鼠10只为正常对照组，成模后大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、酸柏栀油软胶囊高剂量组、酸柏栀油软胶囊中剂量组、酸柏栀油软胶囊低剂量组。每天固定时间按1 ml/100 g剂量灌胃，正常对照组和模型对照组给予等量生理盐水，阳性对照组给予盐酸二甲双胍(400 mg/kg)、干预组分别给予酸柏栀油软胶囊0.450 g/100 g、0.180 g/100 g、0.072 g/100 g灌胃〔6〕，每天1次，连续灌胃8 w。

1.5标本收集 干预8 w后分别用代谢笼收集大鼠24 h尿液，离心后，-20℃保存。用10%水合氯醛麻醉后腹主动脉取血，4℃，3 000 r/min离心15 min，取血清保存于-80℃冰箱中待测。

1.6血、尿生化指标检测 运用血糖检测仪测定空腹血糖，运用全自动生化分析仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C，BUN、Scr的检测按照试剂盒说明书操作。

1.7统计学方法 应用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、Kruskal-WallisH检验。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 成模初期，模型组生长发育良好，与正常对照组大鼠相比毛色变化不明显，随后开始出现饮食、饮水量和尿量增多，体重降低，毛色暗淡发黄。随着干预的进行，模型组大鼠生长发育形态开始出现差异：正常对照组大鼠活泼好动，模型对照组大鼠精神颓靡，极度消瘦，毛色粗糙暗淡发黄，饲养箱内终日不净，排泄物较其他组多且酮臭味重，各干预组大鼠毛发较模型对照组有光泽、精神状态佳。实验期间有9只大鼠死亡。

2.2各组大鼠体重比较 注射STZ前，经高糖高脂饲料喂养实验组大鼠体重显著高于正常对照组(P<0.05)；在干预4 w末，各干预组体重均显著低于阳性对照组(P<0.05)，酸柏栀油软胶囊高剂量组体重显著高于模型对照组(P<0.05)，而酸柏栀油软胶囊中、低剂量组体重与模型对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；在干预8 w末，各干预组体重均显著高于模型对照组(P<0.05)，酸柏栀油软胶囊高剂量组体重与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，而酸柏栀油软胶囊中、低剂量组显著低于阳性对照组(P<0.05)。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠体重比较

与正常对照组相比:1)P<0.05；与模型对照组相比:2)P<0.05；与阳性对照组相比:3)P<0.05；下表同

2.3各组空腹血糖比较 注射STZ前，经高糖高脂饲料喂养实验组大鼠血糖显著高于正常对照组(P<0.05)；在干预4 w末，模型组及酸柏栀油软胶囊低剂量组血糖显著高于阳性对照组(P<0.05)；在干预8 w末，酸柏栀油软胶囊高、中剂量组及阳性对照组血糖显著低于模型组(P<0.05)，酸柏栀油软胶囊高剂量组血糖与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，酸柏栀油软胶囊中、低剂量组血糖显著高于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组空腹血糖比较

2.4各组血清HDL-C、LDL-C、TG、TC水平比较 酸柏栀油软胶囊高剂量组及阳性对照组HDL-C水平显著高于模型对照组(P<0.05)，酸柏栀油软胶囊高剂量组HDL-C水平与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，酸柏栀油软胶囊中、低剂量组的HDL-C水平与阳性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；酸柏栀油软胶囊高、中剂量组及阳性对照组LDL-C水平均低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而酸柏栀油软胶囊的高剂量组LDL-C水平与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；酸柏栀油软胶囊各组及阳性对照组的TG水平均低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；酸柏栀油软胶囊高、中剂量组TC水平均低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组血清HDL-C、LDL-C、TG、TC水平比较

2.5各组Scr、BUN水平比较 酸柏栀油软胶囊组Scr水平均显著低于模型对照组(P<0.05)，但显著高于阳性对照组(P<0.05)；酸柏栀油软胶囊高、中剂量组的BUN水平显著低于模型对照组(P<0.05)，且高剂量与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠Scr、BUN水平比较

3 讨 论

酸柏栀油软胶囊是由酸枣仁油、栀子油、柏子油以3∶3∶1压制而成，酸枣仁乃鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，柏子仁为柏科绿乔木植物侧柏的干燥成熟种仁，栀子系茜草科植物栀子的干燥成熟果实，其主要成分为油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸和维生素E〔11〕。本研究表明酸柏栀油软胶囊对于DN大鼠的血糖、血脂和肾功能改善具有积极作用。

本研究结果表明酸柏栀油软胶囊高剂量组能有效改善DN大鼠症状，改善DN大鼠的糖代谢紊乱，降低血糖值。糖尿病患者在持续高糖状态下，氧自由基生成增多，抗氧化能力下降，产生氧化应激，促进DN的发生、发展〔12〕。肾组织氧供丰富，活性氧产生较多，同时肾组织中抗氧化酶发生糖化或氧化，使肾组织抗氧化能力明显降低造成氧化应激状态〔13〕。维生素E是一类具有抗氧化作用的营养素，定位于细胞膜并且具有较强的脂溶性，能够增强细胞的抗氧化力并保护细胞免受氧自由基的损伤〔14〕。研究证实维生素E可以通过降低氧化应激水平、调节过氧化物酶体增生激活型受体(PPAR)-α和PPAR-γ的表达、改善脂质代谢来减轻糖尿病患者的胰岛素抵抗，发挥抗糖尿病作用〔15〕，有临床研究已经报道了糖尿病患者在接受高剂量维生素E的治疗后肾功能得到了改善〔16〕。同时，酸枣仁的药理成分主要包括生物碱、皂苷和黄酮，具有良好的抗氧化活性〔17〕。这都有助于酸柏栀油软胶囊发挥降血糖和改善肾功能的作用。

本研究结果表明酸柏栀油软胶囊高剂量可以有效改善DN大鼠的脂代谢紊乱，降低LDL-C、TG、TC水平，升高HDL-C水平，这与前期的研究结果一致〔7〕。动物实验表明，膳食饱和脂肪酸可降低胰岛素敏感性，而膳食长链n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)可增强胰岛素敏感性、防止胰岛素抵抗的发生〔18〕，通过给小鼠喂以多不饱和脂肪酸2 w后血清胆固醇(CH)和TG水平分别降低50%和60%〔19〕。研究认为，PURA可能是通过参与脂代谢酶、LDL受体途径、PPAR途径等机制发挥调节血脂的作用〔20〕。

各干预组的Scr、BUN水平均低于模型对照组，表明酸柏栀油软胶囊可以改善DN大鼠的肾功能。中药酸枣仁的主要成分之一是酸枣仁皂苷A，有研究表明：给予糖尿病模型大鼠酸枣仁皂苷A后，肾小球细胞凋亡明显减少，同时肾组织的Bcl-2蛋白表达显著增加，Bax、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶9和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3蛋白表达显著减少，提示酸枣仁皂苷A可能通过抑制凋亡蛋白Bax的活性和增强Bcl-2的活性，从而抑制肾组织细胞的凋亡，发挥保护肾脏的作用〔21〕。此外，正常大鼠腹腔注射酸枣仁皂苷后，TC、LDL-C含量明显降低，HDL-C含量明显升高〔22〕，这也与本研究中观察到的结果一致。