培哚普利抗绝经后骨质疏松的作用与Wnt信号通路的关系

薛青 王玲玲 钟奕

(中山大学 1附属第五医院老年病科，广东 珠海 519000；2附属第七医院老年病科)

肾素-血管紧张素-醛固酮系统各组分存在于骨组织中，而且调控着骨骼的生长、代谢，血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(ACEI)类药物可能有改善骨质疏松的作用〔1〕。在临床工作中课题组也观察到培哚普利可降低绝经后骨质疏松伴高血压患者的骨转换指标，可改善原发性骨质疏松患者的骨痛症状〔2〕；随之的动物实验也得出培哚普利可促进维甲酸致骨质疏松大鼠的骨形成，增加大鼠的骨质量，提高骨密度(BMD)，而且其促进骨形成的作用呈剂量依赖性，8 mg/kg的培哚普利作用较为明显〔3〕。本实验探讨培哚普利对卵巢去势大鼠Wnts信号通路相关因子的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用SPF级3月龄SD雌性大鼠50只，体重230～250 g，购自北京维利通华实验动物技术有限公司，出厂前已按实验的要求造模(见实验分组)。全部按SPF级实验动物管理标准进行饲养和操作。

1.2药品与主要试剂 培哚普利(施维雅天津制药有限公司)。戊酸雌二醇(E2)、戊巴比妥钠(武汉贝尔卡生物医药有限公司)；E.Z.N.A.TM脱氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA)/蛋白质分离试剂盒(OMEGA)；PrimeScriptTM一步法实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒版本2、RNA干扰剂〔TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司〕；引物和探针(上海辉睿生物科技有限公司)。

1.3主要仪器 小动物电子分析天平(德国Sartorius公司)；双能X线BMD测定仪(美国Hologic公司)；DSHZ-300型恒温水浴箱 (中国太仓市科教器材厂)；高速低温离心机(ALC 公司)；自动生化分析仪(美国Beckman 公司)；RT-qPCR仪(美国ABI公司)；IMS-20全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)；超低温冰箱(日本Sanyo公司)。

1.4实验动物与分组 50只SD大鼠分为3组：正常对照组10只，假手术(Sham)组10只，去卵巢组30只；去卵巢组大鼠摘除双侧卵巢；Sham组大鼠仅切除双侧卵巢周边脂肪组织；大鼠摘除卵巢4 w后，用3%戊巴比妥钠溶液1 ml/kg进行腹腔麻醉，采用双能X线BMD测定仪活体测量大鼠双侧股骨的BMD的变化。 将去卵巢组中的30只大鼠随机分为3组，分别为卵巢去势(OVX)组、培哚普利组、E2组各10只。各组大鼠均单笼饲养，自由进食饮水。饲养环境温度 25℃，12 h明暗交替照明，环境安静，通风良好。

1.5药物干预 实验第5周开始给药干预，培哚普利组给予培哚普利4 mg/kg灌胃，E2组给予1.2 mg/kg戊酸E2灌胃，正常对照组、Sham组及OVX组大鼠给予相同体积蒸馏水灌胃，1次/d，持续给药12 w。各组大鼠每周称体重1次，以便适时调整给药量。

1.6取材与指标测定 双侧股骨处理：心脏彻底抽血处死所有大鼠，迅速取出处死大鼠的两侧股骨，剔除周围软组织后，测量左侧股骨BMD，取出右侧股骨后立即装入冻存管中置于液氮中冻存，用于提取RNA。

1.7引物设计与合成 本实验中所用到的引物序列用Primer3.0软件设计，经对比分析后委托上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.8引物稀释与保存 引物工作液为10 μmol/L，将储存液稀释10倍即成工作液。引物及探针使用前先离心，用RNA酶处理(RNase Free)水溶解，充分震荡后稀释至终浓度为10 pmol/μl，分管备用。引物及探针序列见表1。

表1 引物及探针序列

1.9骨组织中总RNA的提取、清洗及溶解

1.9.1从液氮中取出冻存的股骨，研磨至成粉末状，每50 mg样品中加入2 ml RNA干扰剂，剧烈摇晃充分混匀，使裂解液均匀分布于细胞表面，平置10 min后将匀浆液转移到离心管中，室温静置5 min，12 000 r/min 4℃离心5 min；向裂解液中加入200 μl氯仿，上下震荡15 s，待溶液充分乳化后在室温静置5 min；12 000 r/min 4℃离心5 min；吸取上清液至另一离心管中加入等体积的冷异丙醇，充分混匀后，室温静置10 min，12 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清，加入400 μl 75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12 000 r/min 4℃离心15 min后弃去乙醇；加入适量的RNace-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

1.9.2RNA浓度测定 紫外分光光度计(Nanodrop 2000)测定 RNA浓度和纯度，在电脑上记录相应编号的浓度及其光密度(OD)260/OD280比值，最后保存数据。

1.9.3RNA质量分析 OD260/OD280比值在1.8～2.0为RNA纯度很高，<1.8可能存在蛋白质污染，>2.0说明可能存在异硫氰酸胍等有机溶剂残留污染。另外取部分 RNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，进一步确定RNA的完整性和受污染情况。

1.10RT-qPCR 根据PrimeScriptTM一步法RT-PCR试剂盒要求设定反应体系：将试剂盒中的缓冲液、RNase Free水及引物、探针在室温下融解，短暂离心后按计算好的剂量依次加入PCR管中，酶混合剂后加，使用完毕立即放回-20℃冰箱中，注意探针在使用过程中始终保持避光；将加入的试剂迅速混匀，并平均分配到96 孔板中，最后加入模板RNA，仔细贴上贴膜。每孔总体积25 μl，每个样本设3个复管。实验中每一组样本均设计阴性对照(NTC)，即在反应中用RNase Free水来代替模板RNA，其他反应体系的种类和上样体积均不变，从而监测体系是否受到污染；将96孔板进行短暂离心，使所有反应液离开管壁回到底部；将96孔板放入PCR仪中进行PCR 反应，逆转录50℃30 min，预变性95℃2 min，变性95℃10 s，退火、延伸55℃40 s，40个循环。反应完成后输出实验结果，保存数据；用TaqMan探针法进行相对定量分析，以 β-actin 作为内参基因，2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。

1.11统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、Dunnettt检验。

2 结 果

2.1股骨BMD结果 与正常对照组BMD〔(0.067±0.003)g/cm2〕相比，Sham组〔(0.067±0.003)g/cm2〕无明显变化(P>0.05)；与Sham组相比，OVX 组BMD〔(0.038±0.003)g/cm2〕显著降低(P<0.01)，降幅为20.19%；与OVX组相比，E2组BMD〔(0.067±0.003)g/cm2〕上升20.60%(P<0.01)；与OVX组相比，培哚普利组BMD〔(0.049±0.002)g/cm2〕有所回升(P<0.05)，升幅为7.40%，回升程度远不如E2组明显(P<0.01)。

2.2Wnt3a/LRP5/β-catenin mRNA表达 与Sham组比较，OVX组Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表达分别下降26.00%(P<0.01)、18.12%(P<0.05)、38.77%(P<0.01)，培哚普利组可上调Wnt3a、LRP5、β-cateni的mRNA表达(P<0.05)，分别比OVX组上调了8.11%、9.37%、18.23%(P<0.05)。E2组明显上调Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表达，与OVX组相比，分别上调了27.62%、19.05%及50.30%(P<0.01)，见表2。

表2 股骨Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表达水平比较

与Sham组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与OVX组比较：3)P<0.05；4)P<0.01

3 讨 论

与正常对照组相比，Sham组BMD未见明显差异，说明手术本身对BMD无明显影响。OVX组股骨BMD 显著降低，而给予戊酸E2和培哚普利后，BMD有所升高，这表明E2和培哚普利均可抑制去卵巢导致的大鼠BMD降低，但后者远不如前者明显。由于体重的增加对BMD会造成一定的干扰，为排除干扰，本实验将BMD值除以大鼠处死前的体重再乖以100以校正，校正后的培哚普利组BMD比Sham组高，说明培哚普利可提高去卵巢大鼠的BMD。

临床研究表明，雌激素治疗可增加血管紧张素原、血管紧张素Ⅰ和血管紧张素Ⅱ的循环浓度，降低循环ACE，并改变血浆肾素浓度〔4〕。在雌激素缺乏的动物模型中，卵巢切除术会引起ACE和血管紧张素Ⅱ 1型受体的组织表达上调和血管紧张素Ⅱ2型受体的组织表达降低〔5〕。已有多项人类和小鼠的基因研究和细胞学研究证明，Wnt/β-catenin信号通路在骨骼发育及代谢平衡中起重要作用，包括成骨细胞前体扩增、终末分化、矿化和细胞的凋亡〔6〕。研究发现，成骨细胞持续激活β-catenin可使破骨细胞减少，增加骨量；敲除β-catenin后破骨细胞增加、骨量降低〔7，8〕；而低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5的缺失，成骨细胞的功能和增殖受阻，骨形成受影响〔9〕；此外，Wnt3a、Wnt4、Wnt5a均可影响破骨细胞的分化〔10〕。本研究显示，与Sham组相比OVX组大鼠骨组织中Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA表达均下调，在给予雌激素及培哚普利治疗后Wnt3a、LRP5、β-catenin mRNA的表达均可上升。近年来研究发现硬骨病基因(SOST)通过结合LRP5、LRP6而抑制了Wnt信号通路的激活，从而抑制了骨形成过程〔11〕；在对糖皮质激素诱导的骨质疏松兔研究中发现培哚普利的服用可下调骨组织中SOST mRNA 的表达〔12〕；此外，研究发现血管紧张素Ⅱ可下调成骨细胞中核结合因子(Cbfa)1，Cbfa1可拮抗SOST的表达〔13〕，培哚普利是否通过抑制血管紧张素Ⅱ的生成增加Cbfa1的表达进而减少SOST，启动Wnt通路，从而改善骨质疏松，有待进一步研究。

Wnt信号在骨重建、RANKL再生和SOST拮抗等方面均起到重要的调节作用〔14〕，目前该通路上的相关因子及拮抗因子被视为抗骨质疏松药物研究的新靶点，因此研究药物在该通路中的作用对抗骨质疏松的研究有重要的意义。此研究对靶向Wnt/SOST通路的ACEI抗绝经后骨质疏松的作用与机制研究提供了一定的研究基础，有待进一步探索。

由于实验条件及经费有限，本实验测量骨密度时未能对大鼠进行全身扫描或用定量CT测定，也未能对大鼠骨结构进行生物力学性能检测，这对研究药物的作用来说结果相对片面，另外，用PCR测量相关因子表达时如果增加相应的蛋白免疫印迹技术将更有说服力，这在以后的科研工作中会尽量反省并克服。