脓毒症患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg细胞表达水平及意义

沈业周 余娇阳 周飞 张俭

(杭州师范大学附属医院重症医学科，浙江 杭州 310015)

脓毒症主要是由感染所致的一种全身炎症反应综合征，具有病情凶险、病死率高等特点，发展为脓毒症休克和严重脓毒症，严重威胁人们生命安全及影响生活质量〔1,2〕。因此，早期、准确及快速诊断可改善脓毒症患者预后，具有重要意义〔3〕。微小RNA作为广泛存在于生物体内的高度保守的短小RNA，与多种疾病发生、生理和病理过程关系紧密。研究显示，脓毒症外周血中微小RNA能够在一定程度上反映机体炎症情况，且可判定疾病严重程度〔4〕。脓毒症患者可发生严重的免疫功能紊乱，同时也是引起脓毒症患者死亡的重要原因。CD4+CD25+Treg细胞是新发现的一种负向免疫调节细胞，其可经多途径影响机体的免疫状态〔5〕。本研究探讨脓毒症患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg的表达水平及意义。

1 资料与方法

1.1临床资料 选自2016年3月至2017年12月杭州师范大学附属医院接受诊治的脓毒症患者80例作为研究对象。纳入标准：①经临床指征、生物标志物和微生物学检查等确诊；②患者临床资料完整；③获得知情同意，签订知情同意书。排除标准：①风湿免疫系疾病、器官移植术后者；②慢性器官衰竭或障碍、血液系统疾病者；③精神疾病者；④恶性肿瘤者。纳入的80例脓毒症患者，男47例，女33例；年龄60～79〔平均(69.83±6.57)〕岁；根据患者病情程度分为脓毒症组62例，脓毒症休克组18例。脓毒症组男38例，女24例，平均年龄〔(69.17±5.89)〕岁；脓毒症休克组男9例，女9例，平均年龄(70.43±6.74)岁，另选择同期健康体检者60例作为对照组，男37例，女23例；年龄60～78〔平均(69.34±7.53)〕岁。脓毒症组、脓毒症休克组与对照组性别、年龄比较差异无统计学意义(χ2=0.792，P<0.05;t=1.402，P<0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1外周血标本采集 所有研究对象于入院当天抽取外周静脉血4 ml，肝素抗凝，分置于两管中，每管2 ml，分别用于微小RNA-155表达和CD4+CD25+Treg细胞表达检测。

1.2.2微小RNA-155表达检测 采用TRIzol一步法提取总RNA，严格依据美国Invitrogen公司TRIzol试剂盒标准操作。采用紫外分光光度计测定总RNA的吸光度值。引物合成由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：上游引物：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGGT-3′。在荧光定量PCR仪进行RT-PCR。反应总体积为25 μl。反应条件：95℃15 min预变性，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共35个循环。采用2-△△Ct法计算微小RNA-155相对表达量。

1.2.3CD4+CD25+Treg细胞表达检测 取抗凝全血加入试管中，分别加入5 μl的CD25-FITC和CD4-PE单抗，充分混匀后放置于室温条件下避光反应15 min，加入溶血剂500 μl，放置于37℃下10 min，完全溶血后上美国Beckman-Coulter公司流式细胞仪检测CD25强阳性的CD4+CD25+Treg表达。

1.3观察指标 ①观察两组氧合指数和血乳酸水平变化；②观察各组急性生理学及慢性健康状况评分系统(APACHE Ⅱ)评分和序贯器官功能障碍评分(SOFA)变化；③观察各组外周血微小RNA-155表达；④观察各组外周血CD4+CD25+Treg细胞表达。

1.4统计学方法 运用SPSS22.0软件进行t、F及χ2检验。

2 结 果

2.1各组氧合指数和血乳酸水平比较 脓毒症组和脓毒症休克组氧合指数明显低于对照组而血乳酸水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；脓毒症休克组氧合指数明显低于脓毒症组而血乳酸水平明显高于脓毒症组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组氧合指数和血乳酸水平比较

与脓毒症组比较:1)P<0.05；与对照组比较:2)P<0.05，下表同

2.2各组APACHE Ⅱ评分和SOFA评分比较 脓毒症组和脓毒症休克组APACHE Ⅱ评分和SOFA评分明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；脓毒症休克组APACHE Ⅱ评分和SOFA评分明显高于脓毒症组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组APACHE Ⅱ评分和SOFA评分比较分)

2.3各组微小RNA-155相对表达量比较 脓毒症组和脓毒症休克组微小RNA-155相对表达量(1.15±0.21、1.52±0.17)高于对照组(0.64±0.15)，差异有统计学意义(均P<0.05)；脓毒症休克组微小RNA-155相对表达量明显高于脓毒症组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4各组CD4+CD25+Treg细胞表达比较 脓毒症组和脓毒症休克组CD4+CD25+Treg细胞表达水平明显〔(1.54±0.38)%、(3.67±1.78)%〕明显高于对照组〔(0.41±0.12)%〕，差异有统计学意义(P<0.05)；脓毒症休克组CD4+CD25+Treg细胞表达水平明显高于脓毒症组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

脓毒症是感染、休克、烧伤、创伤等危急重患者的严重并发症之一，同时也是诱发多器官障碍综合征、感染中毒性休克的重要因素〔6～8〕。由于脓毒症病情进展迅速、病死率高，给临床工作造成很大困难〔9～12〕。 微小RNA在参与炎性疾病病理生理过程、维持机体自身稳态等方面具有重要效应，其微小RNA-155是近年来学者研究热点之一，被认为是脓毒症炎症网络效应的平衡点参与病理生理过程，可作为脓毒症早期诊断的敏感指标之一，同时也可能是今后脓毒症接受基因治疗和免疫调理的重要靶点〔13，14〕。相关研究报道表明，体内微小RNA-155表达与脓毒症免疫失衡程度存在相关性，从而提高脓毒症病死率，并且对脓毒症病情严重程度具有一定预警作用〔15〕。本文研究表明，脓毒症组和脓毒症休克组微小RNA-155表达增高，且随着病情的发展升高越明显，但其具体作用机制尚未完全阐明，还需后续继续深入研究，提供可靠的参考价值。

学者认为脓毒症的本质主要是机体对细菌感染出现的过度反应，病原体及其毒素导致炎症损害以及机体免疫功能状态具有重要作用〔16，17〕。CD4+CD25+Treg最早在小鼠体内发现，能够特异性地表达CD25，是负向免疫调控的一类细胞，具有广泛的免疫抑制效应，同时还影响机体的获得性免疫和天然免疫，如介导Th1/Th2漂移，调节抗炎与促炎介质水平从而影响免疫细胞如中性粒细胞、T细胞和单核巨噬细胞的凋亡和增殖。CD4+CD25+Treg在脓毒症辅助的免疫调节网络中主要发挥对细胞免疫的抑制作用〔18〕。当脓毒症时机体主要表现为CD4+CD25+Treg水平持续上升，加剧免疫无反应状态。临床上通过对CD4+CD25+Treg检测能够为了解脓毒症患者免疫状态对患者临床治疗和预后具有重要意义〔19〕。本文研究表明，脓毒症组和脓毒症休克组CD4+CD25+Treg细胞表达增高，且随着病情的发展升高越明显。脓毒症患者病情加重，发生细胞免疫低下可能与CD4+CD25+Treg上升有因果关系，认为其机制可能是由于CD4+CD25+Treg通过导致抗炎细胞因子如细胞白介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β的升高，抑制淋巴细胞增殖，引起T淋巴细胞彼此杀伤，使T细胞总数及活化的T细胞数量下降。综上所述，脓毒症患者外周血微小RNA-155和CD4+CD25+Treg呈高表达，且与病情进展密切相关，有助于诊断和指导治疗。