ERCC1、TS及MS状态在老年Ⅲ、Ⅳ期胃癌新辅助化疗中的变化及意义

冯斌 姜雷 张晴 惠丽娜 常静 范开席 赵春红

(1山东省医学科学院附属医院肿瘤内科，山东 济南 250031；2日照市人民医院神经外科；山东省医学科学院附属医院 3放射科；4中心实验室)

核苷酸切除修复交叉互补基因(ERCC)1、胸苷酸合成酶(TS)及微卫星不稳定性(MSI)广泛存在于胃癌组织中，并与患者预后及化疗疗效有关，其中，ERCC1与铂类耐药有关，TS与氟尿嘧啶(FU)类耐药有关。错配修复(MMR)基因(PMS2、MLH1、MSH2、MSH6)及微卫星(MS)状态则在胃癌中尚无确切研究。本研究旨在探讨老年胃癌患者化疗前后ERCC1、TS及MS状态的变化及与化疗疗效的关系。

1 资料和方法

1.1一般资料 2013年11月至2016年11月在我院就诊的66例60岁以上Ⅲ、Ⅳ期局部晚期胃癌患者，男37例,女29例,年龄60～79〔平均(66.5±5.3)〕岁。术前给予4～8个周期转化治疗，平均(5.0±1.0)个周期。分化程度：高分化2例，中分化39例，低分化25例。纳入标准：①初诊且有胃镜活检组织标本，病理组织学证实为胃癌；②应用FOLFOX6方案新辅助化疗成功，能够接受手术治疗；③组织标本符合免疫组化检测的要求。排除标准：①胃镜活检前曾做过放疗、化疗；②新辅助化疗不成功；③肝肾、心、肺功能不全者。用免疫组化法检测ERCC1、TS及MMR蛋白(PMS2、MLH1、MSH2、MSH6)表达水平。病理诊断结果由两名以上病理医生确认。

1.2转化治疗方法 患者术前给予FOLFOX6方案进行转化治疗。第1天：奥沙利铂100 mg/m2静脉输注2 h， 亚叶酸钙400 mg/m2静脉输注2 h；氟尿嘧啶400 mg/m2静脉推注，然后2 400～3 000 mg/m2，持续静脉输注46 h； 每2 w重复1次。连用4～8个周期后，视病情缓解程度选择手术时机。

1.3实验方法 ①TS、ERCC1检测：常规脱蜡、乙醇梯度水化，枸橼酸盐抗原热修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，37℃10 min，滴加一抗(TS、ERCC1，1∶50)，4℃过夜，滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min，后再滴加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色3～10 min，苏木素复染、脱水、透明。中性树胶封片后镜下观察，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性片做阳性对照(所有试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。在显微镜下观察，以细胞质出现棕黄色颗粒染色为阳性表达。②MS状态检测：常规脱蜡，PBS清洗3次，3 min/次。切片经30%过氧化氢-甲醇混合液浸泡10 min后，放入加有柠檬酸钠的染缸，煮沸10 min，自然恢复至室温。PBS洗涤后将兔抗人MLH1、MSH2、MSH6及PMS2按1∶300稀释，每张组织切片滴50 μl，将切片置于湿盒放入4℃冰箱过夜后，室温平衡30 min，用PBS缓冲液洗涤3次，每次10 min，二抗于组织上，放于湿盒室温温育30 min。用辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素及DAB染色30 min，水洗吹干后，用树脂封片〔1〕(所有试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。在显微镜下观察，以细胞核出现棕黄色颗粒染色为阳性表达，若肿瘤组织阴性表达而正常黏膜阳性表达，表示有缺失，提示突变。MLH1、MSH2、MSH6或PMS2中任何一个基因蛋白的表达缺失，即认为MSI肿瘤，否则即为微卫星稳定(MSS)。

1.4病理化疗反应评估 按照美国国立综合癌症网络指南中新辅助治疗后的病理学评估标准分为：0(完全缓解)无癌细胞；1(部分缓解)单个或小灶状癌细胞残留；2(疗效小)残留癌灶版纤维增生；3(疗效差)疗效微小或无疗效；广泛残余癌细胞。在本研究中，0～2定为有反应组，3为无反应组。

1.5统计学分析 采用SPSS24.0软件进行χ2检验、Fisher确切概率检验、McNemar检验、二元Logistic回归分析。

2 结 果

2.1转化治疗的病理化疗反应 病理化疗反应评估显示，化疗反应0、1、2、3者分别为：0(0.0%)、13(19.7%)、37(56.1%)、16(24.2%)。有反应组50例(75.8%)，无反应组16例(24.2%)。

2.2化疗前各指标与新辅助化疗疗效的关系 不同TS、ERCC1、临床分期、分化程度的胃癌患者化疗反应差异均无统计学意义(P>0.05)，MSS患者和男性患者分别有较好的化疗疗效(P<0.01,P<0.05)。见表1。

表1 化疗前各指标与新辅助化疗疗效的关系(n)

1)Fisher确切概率检验

2.3TS、ERCC1、MS状态在化疗前后的变化 TS和 ERCC1在化疗后表达率下降(P<0.001,P=0.024)，MS状态在化疗前后的变化无统计学差异(P>0.05)，见表2、3；分别以化疗反应、分化程度、分期、性别为分层因素进行TS、ERCC1和MS状态在化疗前后变化的分析，TS在化疗有效组、高-中分化组、Ⅲ期、Ⅳ期、女性患者中表达率下降(P<0.05,P<0.01)；ERCC1在化疗有效组、女性患者中表达率下降(P<0.05)；MS状态在各分层因素中无明显变化(P>0.05)，见表4。

2.4与新辅助化疗疗效相关的多因素Logistic回归分析结果 以新辅助化疗疗效为因变量，化疗前TS、ERCC1、MS状态、性别、临床分期和分化程度作为自变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，性别是影响新辅助化疗疗效的危险因素，相对于男性，女性疗效相对较差，OR=0.164，95%CI为0.031～0.864，P=0.033。

表2 化疗前后TS、ERCC1表达的变化(n)

表3 化疗前后MS状态表达的变化(n)

表4 MS状态、TS、ERCC1在新辅助化疗前后的分层分析(n)

3 讨 论

胃癌是常见的恶性肿瘤，在中国，胃癌的发病率占恶性肿瘤的第2位，2003～2007 年全国胃癌发病率为33.14/10 万〔2〕。胃癌又是一个肿瘤异质性疾病，即使在相同的病理分期、临床表现，其治疗结果和预后均有显著的差异。围绕胃癌的基因研究很多，早年报道多集中在ERCC1和TS对胃癌化疗的影响上。ERCC1定位于19号染色体上,是核苷酸切除修复(NER)活性的标志性基因。NER是修复DNA损伤的最主要途径,也是修复草酸铂所致的DNA损伤的最主要途径。Fareed等〔3〕对142例胃食管结合部肿瘤的患者用以铂类为基础的新辅助化疗，观察ERCC1的表达与肿瘤退缩率(TRG)和无进展生存期(DFS)、总生存期(OS)等的关系，发现ERCC1高表达和低TRG、低DFS、低OS有关。Hirakawa等〔4〕对43例局部晚期可切除胃癌患者进行多西他赛和顺铂、替吉奥(S1)联合新辅助化疗，检测化疗后ERCC1表达和化疗疗效的关系，发现ERCC1高表达对化疗抵抗率为82.5%。TS是胸苷酸合成的限速酶,过表达将诱发肿瘤细胞对5-FU产生耐药,因此,TS 是5-FU化疗敏感性的标志基因。张丹等〔5〕通过研究晚期胃癌患者应用S1化疗后TS和疗效的关系，发现外周血TS mRNA表达水平与晚期胃癌患者S1化疗疗效呈负相关性，其水平越高，化疗有效率越低，患者生存时间越短，反之亦然。Chen等〔6〕对胃癌患者应用FLEEOX方案治疗前后均进行了ERCC1和TS表达情况的检测，通过与患者的疗效分析，发现低ERCC1/TS表达者有更好的化疗效果。王维民等〔7〕也对ERCC1和TS与胃癌术后化疗疗效进行了研究，发现ERCC1和TS阳性表达者术后辅助化疗预后差。但在老年胃癌中，尤其在新辅助化疗方面，缺乏相关的研究。本研究说明老年女性胃癌患者化疗可降低ERCC1和TS的表达。TS在高-中分化组及Ⅲ期患者中有显著性降低，而ERCC1不受分化程度及分期的影响。

MMR具有修复DNA碱基对错配的功能，有利于DNA复制维持高保真性，维持基因组的稳定性和降低自发性突变等。该系统任一基因突变，都会导致细胞MMR功能缺陷，结果产生遗传不稳定，表现为复制错误或MS不稳定，因而容易发生肿瘤。MSI状态在结直肠癌的研究中基本已经明确，可作为术后辅助化疗的疗效预测及预后因子，MMR基因表达异常导致的MSI不仅是Ⅱ期结直肠癌预后良好的一个指标，而且也是对FU类药物不敏感的一个预测因素。但在胃癌中相关研究并未明确。Bae等〔8〕分析了464例进展期胃癌患者，发现高度微MSI(MSI-H)和高龄、女性、远端位置、大肿块、肠型有关，多因素分析显示MSI-H是进展期胃癌一个独立的拥有良好OS的因素。Karpińska-Kaczmarczyk等〔9〕对波兰胃癌患者进行了分析，MSI-H发生率为5.6%，和胃癌的Lauren分型有关，和世界卫生组织分类中管状和乳头状分型有关，和年龄、性别、肿瘤位置、侵犯深度、淋巴结状态、是否存在溃疡及淋巴细胞浸润无关。孙晓卫等〔10〕对胃癌患者行FU/ 醛氢叶酸新辅助化疗，检测化疗前后MSI状态的变化，发现新辅助化疗后部分MSI 阳性的病例可以表现为阴性,但对MSI 阴性病例无影响。本研究说明MSI是老年Ⅲ、Ⅳ期胃癌新辅助化疗疗效的一个预测指标。是否新辅助化疗对MS状态有影响，研究发现，新辅助治疗后MSH6缺失可以显著增加，推测该现象可能与新辅助治疗导致MSH6发生继发突变或肿瘤细胞在缺氧环境下下调了MSH6的表达有关〔11〕。本研究中并没有得到阳性结果，仅有MSI发生增加的趋势。

本研究关于TS、ERCC1和MS状态对Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌患者新辅助化疗疗效影响的结果，由于既往研究中多数并未得出阳性结论，本次研究结果是否与样本量太少导致结果有所偏差需进一步扩大样本量验证。

本研究中还显示男性有更好的化疗疗效，复习了以往的相关文献，仅在Bae等〔8〕进行的一项关于胃癌中进行MS检测中发现，MSI-H和女性有关。本研究中MS状态在男女性别中的差异并没有统计学意义。是否男性疗效好与男性体质好、化疗承受力更强有关，还是由于样本量太少导致结果偏差有关，均需扩大样本进一步研究。

TS、ERCC1和MMR蛋白对老年中晚期胃癌的预测及预后作用尚未明确。本研究说明MS状态是老年Ⅲ、Ⅳ期胃癌新辅助化疗疗效的一个预测指标。活检标本和化疗后的手术标本中TS、ERCC1和MS状态表达水平存在不一致性，是否应以手术后标本的检测结果来指导术后治疗需进一步研究。