2017年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区的序列分析

刘晓娉，孙新颖，刘庆慧，万晓媛，黄 倢

（1．青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，农业部海水养殖病害防治重点实验室，青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；2．上海海洋大学，上海 201306；3．济南大学前沿交叉科学研究院，山东济南 250022）

白斑综合征病毒（WSSV）自20世纪90年代首次在中国台湾地区暴发，随后迅速传播至东南亚、印度及南北美洲的许多国家［1-2］，给世界各地的对虾养殖产业造成了重大的经济损失［3-5］，同时也破坏了海洋生态系统的平衡［6］。WSSV的宿主范围较为广泛，可感染40余种甲壳纲动物以及水生浮游动物，并表现出不同程度的感染性［7］，这种广泛的宿主范围被认为是WSSV难以控制并大面积传播的主要原因。

目前在Genbank上公布了7种WSSV病毒分离株的基因组全序列，包括中国的中国台湾株（TW，AF440570，307 287bp）和中国（大陆）株（CN，AF332093，305 107bp）、（CN01，KT995472．1，309 286bp）、（CN02，KT995470．1，294 261bp）、（CN03，KT995471．1，284 148bp）、韩国的韩国株（KR，JX515788，295 884bp）以及泰国的泰国株（TH，AF369029，292 967bp）［8］。尽管总核苷酸序列同一性大于99%，但鉴定出了5个可变基因座，其由两个具有基因组缺失的区域（ORF14／15和ORF23／24缺失区）和3个具有重复单元变化差异（VNTR）的基因座（ORF75、ORF94和ORF125）构成［9］。目前对于WSSV分子病学的研究调查均涉及到 ORF14／15、ORF23／24的缺失情况以及ORF75、ORF94和ORF125的 VNTR数目和单核苷酸多态性的变化。PRADEEP等［10］将ORF14／15、ORF23／24这两个变异区列为 WSSV分子流行病学、遗传进化追溯的首选对象。基因组重复区域ORF75、ORF94和ORF125的VNTR有助于研究WSSV在小地理范围尺度上WSSV的分子流行病学的情况［11］。

本研究针对中国凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）不同养殖区2017年2—6月期间采集的病虾进行检测。共选取42个WSSV阳性样本进行 ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94和ORF125共5个可变区的PCR扩增进行测序，分析各序列的缺失变异情况以及ORF75、ORF94、ORF125扩增序列的重复单元数目及单核苷酸多态性的变化，以期为了解不同凡纳滨对虾养殖区WSSV各毒株间的差异及分子流行病学特征提供参考资料。

1 材料与方法

1．1 样本来源

2017年2—6月，采集来自中国河北、浙江、山东、上海、福建和广东共6个不同省市凡纳滨对虾养殖区的病虾，保存于-80°C冰箱，样品的采集时间、地点及编号见表1。

1．2 WSSV核酸提取

从保存的样本中取约30 mg鳃组织，按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，离心柱型）的说明进行 DNA提取，将提取的DNA样本置于-20℃冷冻保存待用。

1．3 PCR检测

对 WSSV DNA样本采用“GB／T 28630．2-2012白斑综合征（WSD）诊断规程 第2部分套式PCR检测法”为标准进行检测。PCR产物通过用1×TAE电泳缓冲液配制的1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1．4 PCR扩增

将WSSV阳性样本通过各可变区ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94和 ORF125的特定引物进行PCR扩增，PCR扩增体系总量为25 μL，分别为：12．5μL PCRMix（Takara），9．5μL无菌水，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL阳性核酸为模板。PCR扩增反应程序及引物序列见表2。

表1 凡纳滨对虾样品采集信息Tab．1 Sampling information of Litopenaeus vannamei

表2 PCR扩增的引物序列信息及反应条件Tab．2 PCR primers and cycling conditions

1．5 目的基因克隆及序列比对分析

将PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶投影仪中将特异性条带回收至1．5 mL离心管中，利用胶回收试剂盒进行PCR扩增产物的纯化。利用Nano Drop2000检测胶回收产物的浓度，连接于pMD®18-T载体上并转化入Top10感受态细胞中进行扩增，将阳性克隆进行菌液培养，最后将菌液送至生工生物工程（上海）有限公司测序部。将ORF14／15序列与TH-96-Ⅱ分离株进行比对，ORF23／24与中国台湾株进行比对，并分析ORF75、ORF94和ORF125重复单元数目及单核苷酸多态性的变化。

2 结果与分析

2．1 ORF14／15扩增结果

通过对WSSV样本的扩增，共有28份（2#、3#、5#、7#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、22#、23#、25#、26#、27#、28#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、37#和 40#）样本出现了ORF14／15的检测条带，一个泳道内均出现了两条大小不一的条带，这可能是由样品中DNA的断裂或片段不完整造成的。能够成功扩增样品的比率为66．67% （图1）。

2．2 ORF23／24扩增结果

在 ORF23／24扩增中，有 9份（7#、9#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、40#）样本可以扩增出条带，能够成功扩增样品的比例为21．43%。7#、9#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、40#9份样品长度均为1 265 bp（图2）。

2．3 ORF75扩增结果

在ORF75扩增中，共有7份样本检出（7#、9#、11#、14#、27#、37#、40#），检出率为 16．67%（图3）。

图1 ORF14／15的PCR扩增电泳结果Fig．1 PCR amplification electrophoresis results of ORF14／15

2．4 ORF94扩增结果

在ORF94扩增中，只有东营（37#）的样本有目的条带检出，其余地区样本出现特异性条带，检出率为2．38%（图4）。

2．5 ORF125扩增结果

在ORF125扩增中，共有13份样品检出（7#、8#、9#、10#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、36#、37#、40#），检出率为30．95%。共出现4种大小不同的条带，分别为652、633、790、859bp（图5）。

图2 ORF23／24的PCR扩增电泳结果Fig．2 PCR amplification electrophoresis results of ORF23／24

图3 ORF75的PCR扩增电泳结果Fig．3 PCR amplification electrophoresis results of ORF75

图4 ORF94的PCR扩增电泳结果Fig．4 PCR amplification electrophoresis results of ORF94

图5 ORF125的PCR扩增电泳结果Fig．5 PCR amplification electrophoresis results of ORF125

2．6 序列比对

在ORF14／15扩增中，共有4种大小不一的片段扩增出来，即1 270 bp（深土镇、霞美镇、黄骅、台州、海阳）、1 267 bp（深土镇、霞美镇、台州）、1 850 bp（霞美镇、上海）和 1 851 bp（湛江），同推测有最长序列的 TH-96-Ⅱ比对，共有4种缺失情况，即缺失 6 530、6 533、5 950、5 949 bp。

图6 WSSV不同毒株ORF14／15扩增区域序列比对Fig．6 Scheme of deletion region of ORF14／15 in different WSSV strains

在ORF23／24的扩增中，只扩增出一种长度的大小，即1 265 bp。与此区域的中国台湾株比对，缺失了11 945 bp。

图7 WSSV不同毒株ORF23／24区域的序列比对Fig．7 Scheme of deletion region of ORF23／24 in different WSSV strains

ORF75具有长度为102 bp和45 bp两种类型的重复单位。其中102 bp片段的前45 bp的碱基与45 bp的重复单元序列一致。ORF75主要扩增出3种不同大小的片段，分别为：1 739 bp（霞美镇、上海）、2 019 bp（湛江）和 2 310 bp（东营）。将测得的目的片段与重复单元序列比对，结果表明45 bp的75RU数目对应为：2、3、6，而102 bp的 75 RU数目对应为：1、1、3，表 3为ORF75（45 bp）区域各重复单元在 12、27、80位点的单核苷酸多态性。

表3 ORF75（45 bp）区域各重复单元在各位点的单核苷酸多态性Tab．3 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）at various sites in repeated units（RUs）of ORF75（45 bp）region

ORF94只扩增出一条特异性条带，长度为646 bp（东营）。ORF94只存在一种重复单元，大小为54 bp，其重复单元数目及单核苷酸多态性见表4。

表4 ORF94区域各重复单元在48位点的单核苷酸多态性Tab．4 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）patterns at position 48 in RUs of ORF94 region

ORF125扩增序列大小分别为：652 bp（霞美镇、湛江）、633 bp（湛江）、790 bp（滨州）和 859 bp（东营、上海）共4种。其中652 bp和633 bp的重复单元数目为4，790 bp重复单元数目为6，859 bp的重复单元数目为7。RUs为4的霞美镇和湛江的样品共出现6个碱基位置的突变，分别在第9、12、27、50、53、61位的碱基为 G、T、G、G、C、C。RUs为6的36号样品共出现7个碱基位置的突变，第20位碱基突变为G，它碱基突变与RUs为4的情况相同。RUs为7的37和40号样品也是出现6个碱基的突变，分别在第9、12、27、50、53、61位的碱基为 G、T、G、G、C、C。表 5为ORF125扩增序列重复单元数目及在各个位点的单核苷酸多态性。

表5 ORF125区域各重复单元在各位点的单核苷酸多态性Tab．5 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）at various sites in repeated units（RUs）of ORF125 region

3 讨论

白斑综合征病毒在核苷酸序列水平上的缺失变异情况是研究其遗传进化差异的重要内容，差异序列的存在可能对不同WSSV分离株的致病力产生影响。ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94、ORF125这5个可变区目前常被用作遗传标记来鉴定WSSV分离株的变异并分析其病毒扩散模式［12-14］。在目前公布的WSSV全基因组序列中，起源于泰国株的WSSV-TH-96-Ⅱ具有最大的基因组序列，约为312kb，被假定为祖先株［15］。一般将 ORF14／15的扩增序列与 TH-96-Ⅱ进行比对分析，韩国株相对于TH-96-Ⅱ株缺失5 721 bp，与本研究中5 949 bp和5 950 bp大小的缺失片段相近。在 MARKS等［16］关于越南地区WSSV分离株 ORF14／15的扩增中，17种WSSV-VN分离株中有12种有相同的6 030 bp大小的缺失。在TANG等［17］针对马达加斯加岛、莫桑比克和沙特阿拉伯地区毒株的实验中发现，ORF14／15的序列缺失片段为5 950 bp，本研究中涉及到福建霞美镇和上海地区的样本5 950 bp大小的缺失情况与其一致。另外两种片段差异性在于1 850 bp相较于1 851 bp在第990位缺失了一个碱基A。孙新颖等［18］关于浙江、广州、河北黄骥、山东、天津、江苏地区的ORF14／15扩增中出现6 530 bp大小的缺失片段，本研究中福建、河北、浙江和山东地区样本的缺失情况与其一致。本研究中ORF14／15的缺失情况均为大片段的缺失，且缺失片段大小差异不明显，推测ORF14／15的变异是为了感染其它宿主物种的适应策略。

在本研究中ORF23／24扩增序列的缺失片段大小均为11 945 bp，除去缺失部分序列与CN株100%相同。DIEU等［19］在越南中部和南部地区WSSV分离株的 ORF23／24扩增中显示出8 539～12 166 bp的缺失。在我国2014年河北、辽宁、江苏、浙江、广东地区的研究样本扩增中缺失片段大小为 12 064 bp［18］，2015年山东、浙江、天津、海南地区缺失片段大小为12 070 bp［20］。综合以上结果表明，ORF23／24的扩增受地理环境的影响不大，而且缺失大小差异也不明显，均为大片段的缺失，推测较大片段的缺失会给WSSV带来复制优势和对外部环境适应性的增加。

本研究中ORF75的总RUs数目为3、4、9共3种类型，其中45 bp的数目为2、3、6，102 bp的数目为 1、1、3。DURAN-AVELAR等［21］发现，ORF75的RUs数目介于5～20之间，DIEU等［22］在越南发现了7RUs的单倍型，其中包括6个45 bp的RUs及1个102 bp的 RU。在2015年山东、天津、浙江地区的研究样本中总ORF75的RUs数目为 2、3、4［20］，陈红莲等［23］在 2016年安徽合肥、六安、滁州的样本中检测出3、6、9、10和11共 5种 RUs。相较于国外，国内部分地区ORF75 RUs出现了2和3两种较小的RUs。

ORF 94的RU为54 bp，本实验仅扩增出一个样本。WONGTEERASUPAYA等［24］在研究2000—2002年间泰国地区 WSSV样品时显示ORF94的RUs差异很大，范围从6～20 RU。目前在国内外的研究报道中其RUs数目介于2～20之间，其中 6RUs为常见基因型［25］，与37号（东营）样品的RUs数目一致。除此之外，其重复单元会在第48位出现单核苷酸多态性。分析37号样本序列，发现其在48位的碱基为 T、T、T、T、G、G，与 SINDHUPRIYA等［26］在 ORF94扩增中 SNP的研究结果一致。表现出了单核苷酸多态性位点低频率的变异情况。

相对于 ORF75和 ORF94的检出情况，ORF125的检出率相对较高，为30．95%，其RUs数目分别为4、6、7。其中6RUs和7RUs两种基因型常分布于越南［27-29］，同时在2016年安徽省的六安、合肥、芜湖、滁州以及池州的样本中也出现了相同的两种重复单元数目［23］。而在2015年山东、天津、浙江、海南地区以及2016年日照、唐山、黄骅、沧州、秦皇岛、宁波地区ORF125的RUs分别为 3、5、6和 4、5、6［20，30］，本实验 VNTRs的研究结果与其差异较大。研究结果表明，ORF125的VNTRs在不同年份受地域环境及地区的影响相对较小，出现较多的交叉情况，有一定的规律可循。除此之外，福建霞美镇及广东湛江的样品与以往研究相同，均在 9、12、27、50、53、61位点出现了碱基突变［20］，表现出ORF125的SNP均一性及稳定性。

本研究通过对2017年样品的扩增发现，相较于2014—2015年的研究结果，ORF14／15的缺失程度有所增大，而ORF23／24的缺失片段大小差异并不明显，表现出不同地区及年份的稳定性。ORF75、ORF94、ORF125的 RUs及 SNP表现出高度多态性的同时并有一定规律可循。据此推测较大程度的缺失以及重复单元数目的变化可能受环境选择压力的影响，更有利于病毒的复制及传播，而其对WSSV的毒力大小是否产生影响还需要进一步的探究。