一株致病性粪肠球菌的分离与鉴定

范 辉 将乐县动物疫病预防控制中心 福建将乐 353300

肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分，通常在引起腹腔和盆腔感染所分离的混合菌中发现，以往认为肠球菌是对人类无害的共栖菌，但近年研究已证实了肠球菌的致菌力。在需氧革兰氏阳性球菌中，它是仅次于葡萄球菌的重要院内感染致病菌，肠球菌亦可引起院外感染。肠球菌不仅可引起尿路感染、皮肤软组织感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等[1]。本试验的病原菌分离自1羽发病雏鸡的肝脏及心脏。

1 病原菌的分离与鉴定

1.1 材料和方法

1.1.1 材料 病料来源于1羽发病雏鸡，其症状表现为精神沉郁，羽毛蓬松，步态不稳，剖检可见卵黄吸收不良，肝脏土黄色，其他未见明显变化。病菌即分离自该雏鸡的肝脏及心脏。

1.1.2 方法

1.1.2.1 培养基的制备 血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、普通琼脂平板、营养肉汤液体培养基，按常规方法制备，灭菌，4℃冰箱保存，备用。

1.1.2.2 细菌分离 无菌取患鸡心脏及肝脏于血平板琼脂培养基上划线，37℃培养24 h。而后，挑取形态一致的菌落进行纯培养。

1.1.2.3 形态学观察 将纯培养细菌涂片，进行革兰氏染色、镜检，观察细菌形态和着色情况。

1.1.2.4 生化试验 纯化后的细菌分别进行吲哚、MR、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、尿素分解酶试验、枸橼酸盐利用试验及三糖铁培养基接种试验。

1.1.2.5 药敏试验 将纯培养菌液调至0.5个麦氏单位，取该菌液0.1 mL，均匀涂满普通琼脂平板，药敏片均匀贴于琼脂上，不得移动。

1.1.2.6 动物试验 分离菌株18 h血清肉汤培养物离心后，取其菌体，分别腹腔注射体重15～20 g的小白鼠4只(剂量0.2 mL/只)，设对照组3只；颈部注射1日龄雏鸡15羽，设对照组3羽。注射后定时观察、记录。死后剖检，并分离细菌。

1.2 结果

1.2.1 形态观察和培养特性 剖检病料经涂片、镜检可见有少量圆形或椭圆形、呈单在或短链状排列的革兰氏阳性球菌。从肝脏及心脏中分离得到的菌株在血平板上经37℃培养24 h后，形成灰白色、不透明、表面光滑、直径0.5～1 mm的圆形菌落，有溶血现象；经涂片、染色后，镜检发现为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰氏阳性球菌，不形成芽胞。液体培养物呈轻微混浊，可见少量絮状沉淀；均以短链为主，革兰氏阳性，有时老龄培养物会出现阴性；在普通琼脂上生长不良，可见针尖大小的S型菌落；在麦康凯琼脂上不生长。

1.2.2 生化试验 该菌可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇；吲哚试验及触酶试验为阴性，MR、尿素分解酶试验为阳性；三糖铁试验斜面产酸、穿刺产酸产气、不产硫化氢（见表1）。

1.2.3 药敏试验 将菌液调至0.5个麦氏单位，取该菌液0.1 mL，均匀涂满普通琼脂平板，药敏纸片按2000年美国NCCLS药敏试验法规制备，采用NCCLS法规（2000）判定标准进行判定，结果见表2。1.2.4 动物试验 小鼠注射菌液后，可见其背毛逆立，精神沉郁，食欲减退；48 h内小白鼠全部死亡，剖检均可见脑出血，肝、脾肿大，肝表面有针尖大小的出血点；对照组均正常。1日龄雏鸡注射菌液后，雏鸡死前症状表现为精神沉郁，食欲减退，走路不稳，剖检可见败血症变化；对照组正常。

从病死动物的心血中均可分离到接种菌。

1.2.5 结论 初步确定该病菌为链球菌科肠球菌属（Enterococcus）成员。

表1 病原菌的生化反应结果

2 病原菌16S rRNA序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 试验材料 来源于试验1中分离出来的细菌。

2.1.2 引物 用扩增16S rRNA通用引物，由上海生工合成，引物基因序列见表3。引物稀释时，加入灭菌 ddH2O 124 μL， 配成 100 μmol/L 母液 ；取20 μL 母液加入 ddH2O 180 μL， 稀释至 200 μL，配成10 μmol/L使用浓度。

2.1.2 试验方法

2.1.2.1 16S rDNA的提取 挑取镜检纯净菌落，在液体培养基中培养24 h，在无菌条件下取适量菌液于1.5 mL的EP管中，离心后弃去培养液 （尽量干净），加入Lysing buffer 40 μL，放入水浴锅中55℃、10 min及 80℃、10 min后， 再加入 ddH2O 80 μL，12 000 r/min离心10 min，取上清获得模板DNA。

2.1.2.2 PCR扩增 使用16S rRNA基因的上下游引物（27F、92R）进行扩增。 反应总体积 50 μL，反应体系见表4。反应条件与步骤：95℃预变性5 min；94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸1 min30 s，循环29次；72℃、10 min。反应结束后PCR产物于4℃中储存备用。经105 V凝胶电泳20 min后，在紫外检测仪下观察结果。

表4 扩增反应体系

表2 药敏试验结果

表3 引物基因序列

2.1.2.3 PCR产物回收与纯化 40 μL PCR产物样品与 7 μL 6×loading buffer混合， 以 105 V 电泳20 min，结束后割下目的片断，采用小量胶回收试剂盒回收。

2.1.2.4 序列分析 将纯化的16S rDNA样品进行序列测定，采用DNAstar等软件对序列进行分析。2.2 结果

2.2.1 PCR产物电泳结果 16S rRNA PCR结果见图1，图中显示约在1 500 bp处有一条明显的电泳带。

2.2.2 序列分析 应用BLAST程序，将所测序列进行分析，挑选代表种绘制进化树，结果显示所分离的菌株与Enterococcus faecium各菌株之间同源性最高，达99.3%。

图1 PCR产物电泳结果图

图2 依据16S rRNA绘制的进化树

3 讨论与结论

根据本次试验的各项结果，参照文献[2]，确定分离到的细菌为粪肠球菌。

粪肠球菌为条件致病菌，它来源于人和温血动物的粪便，偶尔出现于感染的尿道及急性心内膜炎病例。它能够通过食品对人类造成感染，常见于许多食品如火腿肠、炸肉丸、布丁及经过巴氏消毒的牛乳等，粪肠球菌进入食物链的主要原因是由不卫生的加工条件所致的，一般与直接的粪便感染无关。粪肠球菌引起的感染大多是由于它的侵袭所造成，感染剂量较高，一般大于107个细菌；人、禽感染率最高，亦见于猪、牛、马、山羊、绵羊及兔。

在人医上，该菌已经成为院内感染的第二大病原，但在动物医学领域，对该病原的研究很少。开展肠球菌感染的研究，可以帮助人们提高对肠球菌感染的认识及警惕性[3]。

动物试验表明，该菌有较强的致病性。对小白鼠、雏鸡均敏感，且都能从其实质脏器和脑中分离到接种菌，并与接种菌有一致的培养、生化及溶血特性。

近年来，国内外报道肠球菌的耐药性问题比较严重，其所致感染较难控制。本试验分离菌除对庆大霉素、青霉素、氧氟沙星敏感外，对头孢菌素类等6种药物均表现为耐药性，这一点应引起兽医工作者的注意和重视。