不同纯化浓缩方法制备的新城疫疫苗对SPF鸡免疫效果的研究

陈静怡 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

新城疫 （Newcastle Disease，ND），又叫亚洲鸡瘟、伪鸡瘟、禽副流感Ⅰ型（APM-1）。1926年首先发现于印度尼西亚的爪哇，不久又因在英国新城大面积暴发流行而被发现，因此命名为新城疫[1-2]，它是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染导致禽类发生高热、全身性败血症，是危害养禽业的一种主要传染病。

新城疫发病率高，经济损失大，市场上新城疫的疫苗种类虽然很多，但免疫效果依然不理想。因此，对于新城疫疫苗免疫效果的提升有许多报道，有的认为需要制定合理的免疫程序，如王艳平[3]认为活疫苗与灭活疫苗需交替使用。而灭活苗的免疫主要是肌肉注射，在新城疫灭活疫苗生产过程中，由于收获的尿囊液中混有少量的蛋壳、尿酸盐、杂蛋白质（如卵黄等）、内毒素等，因此，在疫苗使用过程中质量难以稳定，被免疫鸡时常会出现不良的免疫副反应。有一些杂质对疫苗产生免疫抗体还会有影响，而且严重影响单位剂量的免疫效果，严重时可导致免疫失败。另外，抗原中过多的杂质使得抗原灭活过程消耗大量灭活剂甲醛，甲醛在鸡体内残留将影响人类食品安全。本试验通过对比不同浓缩倍数对新城疫疫苗免疫效果的影响来确立最佳的浓缩倍数，为以后制备含新城疫病毒的二联疫苗、三联疫苗、四联疫苗提供试验依据。不仅对疫苗厂家的生产有积极的意义，且对鸡群免疫、食品安全有更重要的意义。

1材 料

1.1 特异性血清及抗原 新城疫病毒 （La sota株）的标准特异性阳性血清由中国兽医监察所提供。新城疫抗原为福州大北农生物技术有限公司自制。

1.2 试验动物及其他 SPF鸡胚：SPF蛋购自山东济南斯帕法斯公司，由福州大北农生物技术有限公司孵化并饲养成所需日龄试验用鸡。

1.3 主要设备 青岛依爱孵化器，Millipore超滤浓缩仪，10K聚醚砜超滤膜包，恒温恒湿箱，单孔微量移液器，八孔微量移液器，振荡器，96孔U型微量板，高速剪切机等。

2方 法

2.1 疫苗的制备

2.1.1 抗原的纯化浓缩 将制备好的抗原使用高速管式分离机采用15 000 r/min、3 kg/min进行离心，离心后取样500 mL标记为抗原h，其余的抗原用Millipore浓缩系统使用10K聚醚砜膜包进行浓缩，在浓缩进行到2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍时分别取样 500 mL，标记为抗原 a、b、c、d、e、f。将制备好未经离心的抗原用Millipore浓缩系统使用10K聚醚砜膜包进行2倍浓缩，标记为抗原g。

2.1.2 抗原的灭活与乳化 将以上各组抗原按照规程要求，加入0.1%甲醛溶液，37℃灭活 16 h，同时按照规程要求对灭活后的抗原进行各项检验，标准应达到要求。将达到要求的抗原按照一定乳化比例（水相与油相比）进行乳化。抗原a～h经灭活乳化后分别标记为疫苗A～H。

2.2 以不同抗原制备成的灭活疫苗免疫SPF鸡后抗体水平检测及攻毒对比试验

2.2.1 免疫试验 试验动物分组：选择95羽由公司自行饲养的30日龄健康SPF鸡，随机分成9组，A～H每组10羽，每羽分别胸部肌肉接种20 μL疫苗A～H；I组5羽为空白对照，每羽胸部肌肉注射PBS 20 μL。 免 疫 后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、70 d、90 d分别采血检测免疫组与对照组鸡的平均抗体水平，同时观察疫苗的吸收情况。

2.2.2 疫苗吸收情况 免疫后第7 d观察每羽鸡的疫苗吸收情况；免疫后第35 d每组剖检2羽SPF鸡，观察疫苗注射部位情况；对照组剖检1羽。

2.2.3 攻毒对比试验 试验动物分组：选择95羽由公司自行饲养的30日龄健康SPF鸡，免疫组每组10羽，I～VIII组分别免疫疫苗 A～H；空白对照组5羽，每羽胸部肌肉注射PBS 20 μL。在免疫后第28 d，免疫组和空白对照组每羽鸡肌肉注射新城疫病毒强毒株北京株 0.5 mL（CVCCAV611株，含105.0ELD50）进行攻毒，注射后连续观察14 d。注射强毒后SPF鸡死亡的，为攻毒未保护；SPF鸡未死亡的，为攻毒保护。

3 结果与分析

3.1 疫苗免疫后的吸收情况 免疫后第7 d和第35 d观察疫苗的吸收情况，结果见表1。疫苗免疫后第7 d，9组的接种部位肉眼均可见有不同程度的疫苗未完全吸收现象，其中G组个别SPF鸡在接种部位可见较严重红肿，其他8组与对照组差异不显著，注射部位附近均发现有少量出血点。

疫苗免疫后第 35 d，每组各剖检2羽SPF鸡进行观察 （对照组剖检1羽），G组疫苗没有被完全吸收，注射部位附近有少量乳黄色黏稠状液体，并有少量出血点，而其他8组未发现有肉眼可见的变化。

表1 疫苗的吸收情况

3.2 疫苗免疫后的抗体水平 疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、70 d、90 d 分别采血测HI抗体水平，结果见表2，并绘制出抗体水平变化曲线图，见图1。

表2 SPF蛋源试验鸡新城疫HI抗体水平

图1 乳化后各组疫苗抗体水平的消涨曲线

3.3 疫苗免疫后的攻毒保护情况 攻毒试验组在疫苗免疫后的第28 d，注射强毒进行攻毒，攻毒保护结果见表3。

表3 SPF蛋源试验鸡新城疫免疫攻毒保护情况

4讨 论

由疫苗吸收试验可以发现G组有较大的不良反应，这可能是因为G组疫苗没有经过离心纯化直接进行浓缩，在这过程中不仅抗原浓缩了，疫苗中的杂质如蛋壳、卵黄等也进行了浓缩，增加了疫苗中杂质的含量，因此出现了较大的不良反应，而进行了离心纯化的疫苗组与对照组 （接种PBS）没有明显差异，可见经过离心纯化后，疫苗内杂质明显减少。

由疫苗免疫后的抗体水平试验可以发现：未进行浓缩的H组，抗体水平较低，特别是在14～45 d，H组与其他组的抗体水平差异极显著。

从浓缩倍数方面分析，当浓缩倍数越高时，抗体水平也越高，并且攻毒保护率可达9/10，而疫苗未经浓缩的其抗体水平相对较低。未经离心直接2倍浓缩的G组与经过离心后2倍浓缩的A组，在抗体水平表现上虽然差异不显著，但是未经离心直接浓缩的由于杂质含量较多，所以在疫苗免疫后其吸收效果也较不理想。因此，如果只是为了提高抗原含量而只进行浓缩、未进行离心是不可取的，它将会影响疫苗的免疫效果。

从图1可知，各组在第7～14 d，抗体均有一个成倍增长的过程，而第14～21 d，抗体的增长速度放缓，约第21 d达到最高水平，而在第21 d后抗体水平逐渐下降，下降速度缓慢。并且发现浓缩倍数越高，下降速度越慢，浓缩倍数低下降速度快。各组的抗体水平在免疫后第14 d均表现出显著差异，这说明不同浓缩倍数对于抗体水平影响极大，这与王春华[4]的研究结果相一致。赵继勋[5]认为新城疫抗体只要达到8log2及以上就可以抵抗野毒的感染，而本试验中经过离心后的抗原经5倍以上浓缩，抗体水平最高，均可达到8log2以上。