外源性CC10基因表达对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

张怀波，马荣龙，张德景

（河南省濮阳市油田总医院 普外三科，河南 濮阳 457001）

原发性肝癌是指发生于肝细胞内或者肝内胆管细胞的癌症，是我国常见的恶性肿瘤之一，病死率居全国恶性肿瘤第二位，其中绝大多数为肝细胞癌。治疗困难，极易复发[1-2]。Clara细胞分泌蛋白10（CC10）又名子宫珠蛋白，由固醇诱导产生，隶属分泌珠蛋白家族，具有多种生理功能，在抗炎和免疫调节等生理活动中发挥重要的作用[3-4]。CC10主要在与外部环境直接相通的人体器官上皮细胞中表达，包括鼻、舌下腺、支气管、肺和乳腺等[3，5-6]。研究表明，CC10是炎症和过敏反应的重要介质，是呼吸系统恶性肿瘤的早期标志物[7]。目前对CC10的研究多集中在乳腺及呼吸系统，在肝癌细胞中尚未见研究报道。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是细胞周期素家族的关键成员之一，通过调节G1期正向调控细胞周期进展[8]。Cyclin D1的过表达可导致增殖失控，引发细胞癌变。研究发现，Cyclin D1过表达可能是肝癌发生的早期标志，在肿瘤分化中起重要作用，对肝癌的诊断及患者预后有重要的意义[9]。本研究用含CC10基因的重组质粒转染肝癌细胞HepG2，检测外源性CC10对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响以及对Cyclin D1表达的影响，初步探索CC10对肝癌的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2、Hep3B购自ATCC公司；RPMI1640培养液购自GIBCO公司；胎牛血清购自浙江四季青生物科技有限公司；青霉素、链霉素、总蛋白提取试剂盒、胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司；转染试剂LipofectionTM购自InivoGene公司；pcDNA 3.1空载体质粒和反转录试剂盒购自Thermo公司；SYBR Premix Ex TaqTMII购自Takara公司；pcDNA 3.1-CC10质粒由本实验室构建并保存；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；引物由北京六合华大基因科技有限公司合成；BCA蛋白浓度测定试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和HRP标记山羊抗兔抗体购自碧云天生物技术公司；鼠抗人CC10多抗、GAPDH单抗和HRP标记山羊抗鼠抗体购于Santa Cruz公司；兔抗大鼠Cyclin D1抗体购自北京博奥森生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；Transwell小室购自Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 细胞培养与转染

细胞培养于RPMI 1640培养液中（10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素），培养箱设置成以下参数：37 ℃、5% CO2。每隔1～2 d传代1次，选对数生长期细胞进行试验。

将对数期、生长状态良好的HepG2细胞，接种于含RPMI 1640培养液的六孔板上（每孔2×105个细胞），于37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞密度为90%左右时，按照LipofectionTM说明书提示的操作步骤分别用4 μg pcDNA3.1空载体质粒（记为pcDNA 3.1组）和4 μg pcDNA 3.1-CC10质粒（记为pcDNA 3.1-CC10组）转染细胞，每个处理设置3个复孔。

1.3 细胞中CC10和Cyclin D1的表达检测

用TRIzol试剂提取人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2、Hep3B以及pcDNA 3.1组和pcDNA 3.1-CC10组（转染48 h）细胞总RNA，取1 μg RNA作为模板反转录合成cDNA。以此为模板进行qPCR反应。以GAPDH作为内参基因，分别检测CC10和Cyclin D1的相对表达量。CC10的上游引物序列为5’-GATCAAGACATGAGGGAGGCA-3’，下游引物序列为5’-CACAGTGAGCTTTGGGCTATTT-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-CAGCGACACCCACTCCTC-3’，下游引物序列为5’-TGAGGTCCACCACCCTGT-3’；Cyclin D1的上游引物序列为5’-CTGGCCATGAA CTACCTGGA-3’，下游引物序列为5’-GTCACACTT GATCACTCTGG-3’。qPCR反应程序为：95 ℃ 5 min；58 ℃ 30 s，39个循环。扩增结束后，分析溶解曲线，利用2-△△Ct法分析数据。实验重复3次。

1.4 外源性CC10的表达检测

采用Western blotting法。转染48 h后，参照试剂盒说明书步骤提取细胞的总蛋白，并以BCA法对总蛋白定量。将蛋白样品上样至SDS-PAGE凝胶进行蛋白分离后，转膜。取PVDF膜于封闭液中封闭1 h。分别加入1：500倍稀释的CC10多抗、GAPDH单抗和Cyclin D1抗体于4 ℃孵育24 h。经封闭液洗涤后，加入1：5 000倍稀释的二抗于37 ℃孵育1 h。暗室内加入ECL化学发光剂显影后，凝胶成像系统扫描分析。

1.5 细胞活力检测

采用CCK-8法。分别于转染24、48和72 h后，弃培养液，用PBS清洗3次，再加入100 μL无血清RPMI1640培养液和10 μL CCK-8检测液，37 ℃避光孵育2 h，酶标仪检测各孔450 nm处的OD值。

1.6 细胞凋亡情况检测

采用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒。转染48 h后，弃培养液，PBS清洗1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1%的Triton X-100冰浴5 min、加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光1 h，封片后立即在荧光显微镜（×100）下观察。随机选5个视野，对凋亡细胞（发绿色荧光）进行计数，取平均值，计算细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/视野下细胞总数×100%。

1.7 细胞迁移、侵袭能力检测

采用Transwell实验法。将转染48 h后两组细胞制成悬浮液。在Transwell小室的上室中加入300 μL由RPMI1640培养液稀释的细胞悬浮液（约1×105个细胞，0.1% FBS），下室中加入700 μL RPMI1640培养液（20% FBS），每组细胞设3个复孔。置于37 ℃、5% CO2培养箱24 h，用甲醇固定后，0.1%结晶紫于室温下染色20 min，倒置显微镜下随机选取6个视野（×200）对细胞进行计数后取平均值，是为迁移细胞数。

细胞侵袭能力检测需将40 μL稀释过的Matrigel基质胶（基质胶：无血清培养液=1：5）加入Transwell小室内，37 ℃孵育2 h。其余步骤与迁移实验相同。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 CC10在肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达

为了探究CC10在肝癌细胞中的作用，首先通过RT-qPCR检测了其在人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2、Hep3B中CC10 mRNA表达水平，结果如图1所示，与正常肝细胞相较，肝癌细胞HepG2、Hep3B中CC10 mRNA的表达量显著降低（P＜0.05），且CC10 mRNA在HepG2中表达较低，故选择HepG2进行后续实验。

图1 CC10 mRNA在人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2、Hep3B中的表达情况

2.2 外源性CC10在HepG2细胞中的表达

为了检测外源CC10在HepG2细胞中的表达水平，转染48 h后，分别用RT-qPCR和Western blotting分析其mRNA和蛋白表达水平。结果显示，转染后，与pcDNA 3.1组相比，CC10表达水平明显升高（P＜0.05），Western blotting的实验结果与RT-qPCR的结果一致（P＜0.05），见图2。

2.3 外源性CC10对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

为了检测外源性CC10对HepG2细胞增殖、凋亡水平的影响，分别用CCK-8法和TUNEL法检测转染后HepG2细胞的活力和凋亡率。结果如图3所示，与pcDNA 3.1组相比，pcDNA 3.1-CC10组细胞活力随着转染时间的增加而降低（P＜0.05）；转染48 h后，凋亡率明显升高（P＜0.05）。这说明外源性CC10抑制HepG2细胞增殖、促进凋亡。

2.4 外源性CC10对HepG2细胞迁移和侵袭的影响

图2 外源性CC10在HepG2细胞中的表达情况

为了检测外源性CC10对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响，分别用Transwell实验检测转染后HepG2细胞迁移和侵袭能力的变化。结果表明，与pcDNA 3.1组相比，pcDNA 3.1-CC10组细胞迁移和侵袭细胞数量均明显降低（P＜0.05）。说明外源性CC10抑制HepG2细胞增迁移、侵袭，见图4。

2.5 外源性CC10对HepG2细胞中Cyclin D1表达的影响

为了检测外源CC10对HepG2细胞中Cyclin D1表达水平的影响，pcDNA 3.1-CC10质粒转染HepG2细胞48 h后，分别用RT-qPCR和Western blotting分析Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平。结果显示，转染后，与pcDNA 3.1组相比，Cyclin D1表达水平明显下调（P＜0.05），Western blotting的实验结果与RT-qPCR的结果一致（P＜0.05），见图5。

图3 外源性CC10对HepG2细胞增殖、凋亡的影响

图4 外源性CC10对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响

图5 外源CC10对HepG2细胞中Cyclin D1表达水平的影响

3 讨论

近年来肝癌发病率呈上升趋势，给人民的生命健康和社会经济带来巨大的挑战[10]。我国每年约有38万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51%[11]。肝癌患者预后整体较差，主要的治疗方式有手术治疗、肝移植、非手术治疗（包括肝动脉化疗栓塞、射频消融治疗、放射治疗、基因治疗、中医中药治疗等）[12]。基于基因的分子靶向治疗是目前的研究热点之一[13]。

Clara细胞CC10蛋白是一种能抑制肿瘤、抵御炎症反应、维持人体免疫平衡的分泌蛋白，但其作用机制至今不太明确[14-15]。Weeraratna等[16]研究发现，前列腺癌细胞中CC10表达量较正常上皮细胞低，CC10蛋白的表达量下降可作为前列腺癌的一个诊断指标，并且具有预后价值；CC10蛋白具有抗肿瘤增长的活性。Zhong等[17]利用脂质体将外源CC10转染非小细胞肺癌细胞A549，发现外源CC10表达能阻断G0/G1的细胞周期进程，并抑制A549细胞增殖、诱导细胞凋亡，抑制效应可能与Cyclin D1基因的下调有关。Wei等[18]于大肠杆菌中诱导表达并纯化重组大鼠CC10蛋白，然后用重组蛋白处理大鼠ASMCs细胞，结果证明重组CC10蛋白可抑制PDGF诱导的大鼠气管平滑肌细胞增殖和迁移，推测抑制作用可能与抑制细胞周期蛋白D1表达有关。钟声等[19]证明CC10表达下调与NSCLC细胞的凋亡密切相关。最新的一项研究表明，CC10蛋白可通过抑制Fgl2蛋白的表达缓解小鼠肝炎病毒株3诱导的暴发性肝炎[20]。本研究发现，肝癌细胞HepG2、Hep3B中CC10的表达量较人正常肝细胞LO2显著降低。且外源CC10能抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进肝癌细胞凋亡，与前人结果类似。

Cyclin D1属于原癌基因，通过与CDK6或CDK4结合形成复合物在调节细胞周期过程中发挥作用。多种肿瘤细胞中均可检测到该基因的扩增、突变和高表达，且其表达量与患者预后呈显著负相关[21-23]。敖然等[24]发现，Cyclin D1蛋白在人正常癌旁组织中不表达，而在肝癌细胞的细胞质和/或细胞核及肝癌组织中高表达量。Zhao等[25]研究发现，Cyclin D1蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达量显著高于癌旁组织。此外，Cyclin D1蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率明显高于正常宫颈组织[26]。因此，下调Cyclin D1基因的表达可能是抑制肝癌细胞生长的一种可能的机制。本研究中，外源CC10基因表达使得肝癌细胞HepG2中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平明显下调。因此，我们推测CC10可通过下调Cyclin D1的表达抑制肝癌的发生发展。

综上所述，外源CC10基因表达对HepG2细胞具有抑制增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡的作用，其机制可能与下调Cyclin D1蛋白表达有关。