免疫细胞及肿瘤标志物与高危型HPV感染宫颈癌患者HPV水平的相关性及与预后的关系

武丽蕊，王兰朋，李红霞，孙岩

河北中石油中心医院1妇科，3实验室，河北廊坊065000

2廊坊市人民医院胸外科，河北廊坊0650000

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率不断升高且呈年轻化趋势[1]。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一种DNA病毒，其传播方式主要是性接触。通常低危型HPV可能引起生殖器尖锐湿疣，而高危型HPV可能引起宫颈癌[2]。宫颈癌的发生不仅与患者伴有HPV感染有关，而且与患者的机体状态有关，如患者的免疫力、体内微环境等。CD4+、CD8+细胞与机体T细胞的表达有关，CD56+细胞与机体自然杀伤（natural killer，NK）细胞的表达有关，这两类细胞都是免疫细胞，当其水平降低时，机体免疫功能下降，不能清除体内的HPV，长期的HPV感染会引起宫颈癌。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg），对机体的免疫功能具有一定的抑制作用，研究报道，这种抑制作用会使基因突变的细胞逃逸免疫监控，导致肿瘤的发生[3-5]。K-ras、Ki-67的阳性表达与细胞的增殖、迁移及血管形成有关[6-7]。HPV感染时间延长，会引起宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），这一阶段的病变是可以逆转的，若感染持续存在，则最后可能发展为宫颈癌，这个过程需要约10年的时间。因此，在宫颈病变早期对容易引起患者免疫力下降的指标及与细胞增殖有关的标志物K-ras、Ki-67进行检测可能有助于宫颈癌的早期预防和诊断。本研究对不同宫颈疾病患者进行免疫细胞和肿瘤标志物检测，发现免疫细胞和肿瘤标志物对宫颈癌患者的早期预防及诊断具有一定的临床意义，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年2月至2017年10月于河北中石油中心医院诊治的有HPV感染的72例宫颈癌患者、83例CIN患者和50例慢性宫颈炎患者。纳入标准：①根据临床表现和/或活组织检查等病理检查结果，确定组织性质及临床分期、分级[8-9]；②根据荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测结果确定均伴有高危型HPV感染。排除标准：①有免疫系统疾病；②妊娠、哺乳期妇女；③沟通障碍；④近3个月内有免疫治疗、放化疗或其他药物治疗史。纳入的72例宫颈癌患者（宫颈癌组），年龄为26～64岁，平均年龄为（42.6±5.7）岁；临床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期12例；有淋巴结转移28例，无淋巴结转移44例。纳入的83例CIN患者（CIN组），年龄为25～66岁，平均年龄为（41.5±4.9）岁；CINⅠ级23例，CINⅡ级27例，CINⅢ级33例。纳入的50例慢性宫颈炎患者（慢性宫颈炎组），年龄为23～64岁，平均年龄为（40.8±5.2）岁。3组患者的平均年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，且所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器

藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的小鼠抗人CD4、CD8、CD56抗体，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的Treg、K-ras、Ki-67抗体均购自美国BD Bioscience公司；台盼蓝染色液、红细胞裂解液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）均购自上海远慕生物科技有限公司。其中，CD4+、CD8+用于标记免疫细胞中的T细胞，CD56+用于标记免疫细胞中的NK细胞。K-ras、Ki-67可代表细胞的增殖、扩散等能力。采用美国BD Biosciences Accuri C6流式细胞检测仪进行流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测，HPVDNA分型检测仪器购自深圳市科润达生物工程有限公司。

1.3 观察指标和检测方法

所有患者均于入院后第1天抽取空腹静脉血3 ml。使用FCM检测患者外周血中CD4+、CD8+、CD56+、Treg的水平，使用免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测患者病变组织中肿瘤标志物（K-ras、Ki-67）的表达情况；对比分析3组患者 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD56+、Treg的水平及K-ras、Ki-67的阳性表达情况。FCM检测步骤：取各组患者外周血后，加入抗凝剂保存于4℃冰箱内，于1 h内进行检测；将淋巴细胞浓度调整为约5×106/L，使用台盼蓝染色，确定活细胞率>85%，保证测试的准确性；将100 μl全血加入测定管中，加入 PBS 稀释至 200 μl，加入 20 μl FCM 专用抗体并混匀；在4℃冰箱内避光孵育30 min；加入红细胞裂解液裂解红细胞，直至液体澄清；使用PBS清洗3次后，加入0.1%的甲醛溶液将细胞固定，在2 h内上机检测。IHC检测步骤：分别取3组患者的病变组织，4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，组织切片；脱蜡水化后，抗原修复；封闭内源性过氧化酶后，充分清洗；4℃孵育一抗过夜；室温放置1 h后，清洗掉一抗，孵育二抗；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色后，复染；镜下观察。K-ras和Ki-67的阳性表达率计算方法：选取视野中1000个细胞，观察阳性细胞比例，0～5%为（-），6%～25%代表（+），26%～75%代表（++），76%～100%代表（+++）。

1.4 随访

所有患者均随访1年，随访方式为电话随访结合上门随访。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者外周血免疫细胞水平的比较

宫颈癌组患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均低于CIN组患者和慢性宫颈炎组患者，但CD8+、Treg水平均高于CIN组患者和慢性宫颈炎组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；CIN组患者的CD4+/CD8+水平低于慢性宫颈炎组患者，Treg水平高于慢性宫颈炎组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 3组患者外周血免疫细胞水平的比较（±s）

表1 3组患者外周血免疫细胞水平的比较（±s）

注：a与慢性宫颈炎组比较，P<0.05；b与CIN组比较，P<0.05

指标CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）慢性宫颈炎组（n=50）36.54±7.23 23.64±5.13 1.55±0.47 16.32±5.17 4.37±1.21 CIN组（n=83）34.68±6.54 24.92±5.46 1.39±0.43a 15.51±4.79 5.32±1.43a宫颈癌组（n=72）26.62±5.46a b 30.46±6.37a b 0.87±0.36a b 11.36±3.87a b 6.14±1.62a b

2.2 3组患者肿瘤标志物阳性表达情况的比较

慢性宫颈炎组、CIN组、宫颈癌组患者的K-ras的阳性率分别为 80.0%（40/50）、77.1%（64/83）、100%（72/72），Ki-67的阳性率分别为12.0%（6/50）、83.1%（69/83）、100%（72/72）；3组患者的K-ras、Ki-67的阳性率比较，差异均有统计学意义（χ2=18.501、121.608，P＜0.05），其中宫颈癌组患者的K-ras、Ki-67阳性率最高。（表2）

2.3 宫颈癌组患者HPV水平与免疫细胞水平及肿瘤标志物阳性表达情况的相关性分析

宫颈癌组患者外周血中Treg、CD8+水平和K-ras、Ki-67阳性表达情况与HPV-DNA水平呈正相关（r=0.546、0.402、0.645、0.713，P＜0.05），而CD4+、CD56+水平与HPV-DNA水平呈负相关（r=-0.478、-0.463，P＜0.05）。

表2 3组患者的肿瘤标志物阳性表达情况[ n（%）]*

2.4 宫颈癌组有无淋巴结转移患者的免疫细胞水平及肿瘤标志物阳性表达情况的比较

宫颈癌组有淋巴结转移患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明显低于无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=6.767、3.389、5.538，P＜0.01）；但CD8+、Treg水平均明显高于无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=9.864、9.607，P＜0.01）（表3）。宫颈癌组有淋巴结转移的患者K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例分别为46.4%（13/28）、50.0%（14/28），均高于无淋巴结转移的18.2%（8/44）、25.0%（11/44），差异均有统计学意义（χ2=6.608、4.718，P＜0.05）。

表3 宫颈癌组有无淋巴结转移患者的免疫细胞水平（±s）

表3 宫颈癌组有无淋巴结转移患者的免疫细胞水平（±s）

指标CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）有淋巴结转移（n=28）21.06±5.47 39.02±5.97 0.62±0.28 10.03±3.08 8.04±1.48无淋巴结转移（n=44）30.12±5.58 24.93±5.87 1.02±0.31 12.21±2.36 4.92±1.25

2.5 宫颈癌组死亡患者与生存患者免疫细胞水平及肿瘤标志物阳性表达情况的比较

随访1年，72例宫颈癌患者中，23例患者死亡，49例患者生存。宫颈癌组死亡患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明显低于生存患者，差异均有统计学意义（t=7.824、8.342、5.704，P＜0.01）；但CD8+、Treg水平均明显高于生存患者，差异均有统计学意义（t=4.023、8.229，P＜0.01）（表4）。宫颈癌组死亡患者的 K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例分别为52.2%（12/23）、65.2%（15/23），明显高于生存患者的18.4%（9/49）、20.4%（10/49），差异均有统计学意义（χ2=8.659、13.866，P＜0.01）。

表4 宫颈癌组死亡患者和生存患者免疫细胞水平（±s）

表4 宫颈癌组死亡患者和生存患者免疫细胞水平（±s）

指标CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）死亡患者（n=23）18.15±5.27 34.15±5.26 0.57±0.27 7.66±2.73 7.95±1.36生存患者（n=49）30.61±6.72 28.76±5.32 1.01±0.32 13.06±2.48 5.29±1.24

3 讨论

免疫系统在肿瘤的发生过程中具有重要的作用，其中，辅助性T淋巴细胞如CD4+细胞等分泌的细胞因子可以提高患者的免疫力，从而杀伤肿瘤细胞，而抑制性T细胞如CD8+细胞等在免疫系统杀伤肿瘤细胞的过程中起负调控的作用，这两类T细胞相互协调、相互制约，共同调节机体的免疫应答[10-11]。CD56+细胞主要存在于血液、脾脏及骨髓等部位，是NK细胞的标志物，在没有抗体和致敏淋巴细胞的作用下，其可以迅速由肿瘤细胞激活，并对肿瘤细胞进行抑制和杀伤。Treg细胞在肿瘤的发生过程中对免疫系统起抑制作用，有助于血液系统中的肿瘤细胞逃脱免疫系统的监控而不被杀死，导致人体肿瘤细胞的积聚[3,11]。K-ras属于RAS家族成员之一，能够编码K-ras蛋白，在正常人体环境中，其能够调控细胞的生长，而在异常人体环境中，其能够促进细胞持续生长，甚至发生基因突变，导致该基因永久活化，进一步引起细胞内信号不能正常转导，细胞持续增殖，发生癌变。Ki-67是细胞增殖的一种标志物，除细胞静止期外，其在细胞分裂的各个时期均有表达，其阳性表达率越高，提示肿瘤细胞增殖越活跃，与肿瘤的发生、转移等有关[12]。文献报道，宫颈癌的发生不仅与患者自身感染高危型HPV有关，而且与患者的免疫功能有关[13-14]，同时检测肿瘤标志物的变化有助于肿瘤的早期发现。

本研究结果显示，宫颈癌组患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均低于CIN组患者和慢性宫颈炎组患者（P＜0.05），说明宫颈癌患者的免疫功能下降，很可能是由于其免疫功能长期处于较低水平，HPV长期感染，导致宫颈癌的发生；宫颈癌组患者的CD8+、Treg水平均高于CIN组患者和慢性宫颈炎组患者（P＜0.05），说明宫颈癌患者的免疫功能被抑制，很可能是因为肿瘤细胞逃逸，导致肿瘤细胞累积，疾病逐渐恶化。3组患者的K-ras、Ki-67的阳性率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中宫颈癌组患者的K-ras、Ki-67阳性率最高，说明宫颈癌细胞增殖活跃能力及细胞迁移能力强于其他两组。随着疾病进展，患者体内相应的抑制性T细胞水平与K-ras、Ki-67阳性表达情况均有升高趋势；而辅助性T细胞水平却降低。本研究结果显示，宫颈癌组患者外周血中Treg、CD8+水平和K-ras、Ki-67阳性表达情况与HPV-DNA水平呈正相关；CD4+、CD56+水平与HPV-DNA水平呈负相关。同时，宫颈癌组有淋巴结转移患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明显低于无转移的患者（P＜0.01），CD8+、Treg水平和 K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例均高于无淋巴结转移的患者（P＜0.05）；宫颈癌组死亡患者的上述辅助性T淋巴细胞水平均明显低于生存患者（P＜0.01），上述抑制性T细胞水平和肿瘤标志物阳性比例均高于生存患者（P＜0.01），进一步证明了随着疾病的进展，患者的免疫力下降，促进了肿瘤细胞的增殖和转移，除免疫功能指标外，K-ras和Ki-67亦可作为肿瘤检测的辅助指标。联合检测患者免疫细胞与肿瘤标志物，不仅对宫颈癌的早期诊断具有重要的意义，而且在肿瘤的发生发展机制中亦具有一定的意义，为宫颈癌的早期预防、诊断及治疗提供了一定的参考。由于时间和技术的限制，本研究在肿瘤的发病机制方面等未进行深入研究，有待于进一步完善。

综上所述，免疫力降低和免疫逃逸在高危型HPV感染患者演变为宫颈癌的过程中发挥了重要的作用，检测免疫细胞和肿瘤标志物，有助于高危型HPV感染宫颈癌患者的早期预防、诊断及预后评估。