氟尿嘧啶植入剂对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响△

黄鹏翀，李晨辉，王焱

河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院1妇科，2麻醉科，河南 洛阳4710000

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在中国其发病率仅次于乳腺癌居第二位，且呈年轻化趋势，严重威胁患者的身心健康[1-2]。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一种临床常用的抗肿瘤药物，可通过抑制核酸的合成而干扰细胞的正常生长，但5-FU存在首过效应，且半衰期短、生物利用度低，易导致骨髓抑制，严重影响患者的疗效及预后[3-4]。为提高5-FU疗效，并降低其不良反应发生率，经过多年的研究，科研工作者终于研发一种缓释植入剂——氟尿嘧啶植入剂[5]。研究表明，氟尿嘧啶植入剂治疗宫颈癌疗效确切，且不良反应较轻，该药可局部缓慢释放5-FU，从而提高肿瘤组织中5-FU的浓度，在增强抗肿瘤疗效的同时，降低不良反应发生率[6-7]。B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）蛋白是Bcl-2原癌基因的编码产物，是一种抗凋亡蛋白，可抑制线粒体释放细胞色素c，从而抑制细胞凋亡。一般认为，caspase 3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒性T细胞（cytoxic T lymphocyte，CTL）杀伤机制的重要组成部分。目前，关于氟尿嘧啶植入剂治疗宫颈癌的研究较少，本研究拟通过观察氟尿嘧啶植入剂对宫颈癌Hela细胞增殖凋亡，以及对Bcl-2、caspase 3蛋白相对表达量的影响，为氟尿嘧啶植入剂治疗宫颈癌的应用提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人宫颈癌Hela细胞株购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库。青链霉素、DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国Gibco公司，放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶试剂、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）液、CCK8试剂盒和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司，膜联蛋白V（AnnexinⅤ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡试剂盒购自美国Immunoway Technoloyg公司，鼠抗β-actin单克隆抗体、兔抗Bcl-2单克隆抗体和兔抗caspase 3单克隆抗体均购自美国Cell Signal Technology公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和HRP标记的山羊抗兔IgG均购自上海生物工程有限公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自美国MilliPore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组宫颈癌Hela细胞在1%青霉素、1%链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2的恒温箱中培养。待细胞融合度为70%～80%时，采用0.25%的胰蛋白酶在37℃恒温箱中消化2～3 min，按照1∶4的比例传代培养。将对数生长期的Hela细胞以每孔5×103/ml的浓度接种于96孔培养板，将分别加入5-FU和氟尿嘧啶植入剂的细胞分别作为5-FU组和氟尿嘧啶组，未处理的细胞作为对照组，每组均设5个复孔。

1.2.2 CCK 8法检测细胞增殖能力根据预实验和参考文献[8-9]的结果，设定5-FU和氟尿嘧啶植入剂终浓度均为20.0 mg/L。5-FU组和氟尿嘧啶组细胞分别给予20.0 mg/L的5-FU和氟尿嘧啶植入剂，对照组细胞未处理，3组细胞干预1、2、3、5、7天后，每孔加入5%的CCK8溶液10 μl，继续培养箱孵育2 h。采用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度（optical density，OD）值，比较3组细胞的增殖能力。实验重复3次，取均值。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况取1×104/ml浓度的细胞悬液接种于12孔板，每孔1 ml，细胞贴壁后，5-FU组和氟尿嘧啶组细胞分别给予20.0 mg/L的5-FU和氟尿嘧啶植入剂，对照组细胞未处理，3组细胞孵育1、3、7天，胰蛋白酶消化后收集细胞。采用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤 3次，加入 500 μl的结合液悬浮细胞，然后暗室中加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC，然后加入5 μl的PI混匀，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次，取均值。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测Bcl- 2、caspase3蛋白的相对表达量 取3组细胞加入相应药物后孵育 1、3、7天，每孔加入 100 μl的 RIPA裂解液，冰浴30 min后，4℃低温12 000 r/min离心10 min，BCA法测定蛋白含量，每孔加入50 μg的蛋白样品，SDS-PAGE电泳80～120 V分离蛋白，150 mA的电流将蛋白转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗（稀释浓度为1∶1000）4℃孵育过夜，二抗（稀释浓度为1∶5000）室温孵育2 h，ECL液显影，手动曝光。实验重复3次，取均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，不同时间点比较采用重复测量方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖情况的比较

3组细胞干预不同时间点（干预1、2、3、5、7天）的OD值比较，差异有统计学意义（F时间=356.324，P时间＜0.01）。3组细胞OD值比较，差异有统计学意义（F组间=247.583，P组间＜0.01），其中干预2、3、5、7天时，5-FU组细胞的OD值均低于对照组细胞，但仅干预5、7天时，氟尿嘧啶组细胞的OD值均低于对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；干预2、3、5天时，氟尿嘧啶组细胞OD值均高于5-FU组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），但干预7天时，氟尿嘧啶组细胞OD值与5-FU组细胞比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3组细胞在组间及时间之间存在交互作用（F时间×组间=478.321，P时间×组间＜0.01）。（表1）

表1 不同时间点 3组Hela细胞OD值的比较（±s）

表1 不同时间点 3组Hela细胞OD值的比较（±s）

注：a与对照组比较，P<0.05；b与5-FU组比较，P<0.05

时间干预1天干预2天干预3天干预5天干预7天对照组0.48±0.10 0.83±0.09 1.10±0.11 1.14±0.15 1.20±0.12 5-FU组0.44±0.07 0.65±0.08a 0.84±0.12a 0.82±0.09a 0.81±0.07a氟尿嘧啶组0.44±0.08 0.81±0.07b 1.02±0.15b 0.97±0.12a b 0.83±0.10a

2.2 细胞凋亡情况的比较

3组细胞干预不同时间点（干预1、3、7天）的凋亡率比较，差异有统计学意义（F时间=1453.567，P时间＜0.01）。3组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F组间=1125.628，P组间＜0.01），其中干预3天时，氟尿嘧啶组细胞凋亡率低于5-FU组细胞和对照组细胞，但5-FU组细胞凋亡率高于对照组细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预7天时，氟尿嘧啶组和5-FU组细胞凋亡率均高于对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组细胞在组间及时间之间存在交互作用（F时间×组间=889.674，P时间×组间＜0.01）。（表2、图1）

表2 不同时间点 3组Hela细胞凋亡率的比较（%，±s）

表2 不同时间点 3组Hela细胞凋亡率的比较（%，±s）

注：a与对照组比较，P<0.05；b与5-FU组比较，P<0.05

时间干预1天干预3天干预7天对照组8.44±0.74 12.16±1.12 25.73±1.44 5-FU组8.75±0.84 27.67±2.14a 28.90±2.02a氟尿嘧啶组8.64±0.71 9.78±0.75a b 27.47±0.96a

图1 流式细胞仪检测不同时间点5-FU组和氟尿嘧啶组Hela细胞凋亡情况

2.3 Bcl- 2、caspase 3蛋白相对表达量的比较

3组细胞干预不同时间点（干预1、3、7天）的Bcl-2、caspase 3蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（F时间=385.427、257.634，P时间＜0.01）。3组细胞Bcl-2、caspase 3蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（F组间=245.63、329.116，P组间＜0.01），其中干预3、7天，5-FU组和氟尿嘧啶组细胞Bcl-2蛋白相对表达量均低于对照组细胞，caspase 3蛋白相对表达量均高于对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组细胞在组间及时间之间存在交互作用（F时间×组间=304.776、407.225，P时间×组间＜0.01）。（表 3）

表3 不同时间点3组细胞Bcl- 2、caspase 3蛋白相对表达量的比较（±s）

表3 不同时间点3组细胞Bcl- 2、caspase 3蛋白相对表达量的比较（±s）

注：*与对照组比较，P<0.05

蛋白Bcl-2 caspase 3时间干预1天干预3天干预7天干预1天干预3天干预7天对照组0.99±0.23 1.57±0.34 1.52±0.29 1.07±0.15 0.55±0.20 0.44±0.16 5-FU组1.10±0.37 0.62±0.13*0.52±0.15*1.01±0.27 1.41±0.12*1.57±0.29*氟尿嘧啶组0.99±0.15 0.88±0.23*0.49±0.11*0.99±0.16 1.07±0.12*1.62±0.19*

3 讨论

5-FU自1957年问世以来就已被广泛应用于食管癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤的临床治疗。5-FU可转化为氟尿嘧啶脱氧核苷酸，与胸腺嘧啶合成酶结合，抑制脱氧嘧啶核苷酸转化为胸腺嘧啶核苷酸，从而干扰DNA的正常合成，起到抑制肿瘤细胞生长的作用[10]。研究表明，5-FU抗肿瘤疗效确切，但存在生物利用度低、半衰期短、亲脂性弱、治疗窗窄等缺点，因此，通过对5-FU进行结构修饰或将5-FU包裹于特殊的载体材料中，可以延长5-FU的体内滞留时间，在增强药效的同时，最大限度地降低不良反应而成为研究热点[11-12]。

氟尿嘧啶植入剂是一种新型的5-FU制剂，该药物将5-FU包裹于高分子聚合物骨架中，通过膜层渗透、扩散原理调控5-FU的释放速度和作用时间。氟尿嘧啶植入剂进入特定部位后，可随体液缓慢释放，形成5-FU浓度梯度，具有达到靶向部位的药物浓度较高、药物持续时间长的优势，不仅可保证药物的有效性和稳定性，还能够使靶标之外部位的药物浓度处于较低水平，降低不良反应发生率[13-14]。目前，氟尿嘧啶植入剂已广泛应用于乳腺癌[15]、结直肠癌[16]、胃癌[17]等恶性肿瘤的临床治疗，临床疗效较好，不良反应程度较轻[18]。本研究为进一步巩固氟尿嘧啶植入剂治疗宫颈癌的理论基础，采用宫颈癌Hela细胞探讨氟尿嘧啶植入剂的抗肿瘤作用，并从细胞凋亡方面研究其分子作用机制。

在本研究中，采用CCK8法检测细胞增殖能力，结果表明，5-FU和氟尿嘧啶植入剂均可抑制细胞的增殖能力，但氟尿嘧啶植入剂起效时间较晚，这可能与氟尿嘧啶植入剂属于缓释制剂有关，其达到有效药物浓度需要一定时间。干预7天时，氟尿嘧啶植入剂抑制细胞增殖的能力与5-FU无明显差异，表明氟尿嘧啶植入剂作为5-FU的缓释制剂，该剂型本质上可延长5-FU的作用时间，且疗效确切。流式细胞仪检测细胞凋亡情况结果显示，5-FU和氟尿嘧啶植入剂导致的细胞凋亡率逐渐增加，但随着作用时间的延长，氟尿嘧啶植入剂诱导的细胞凋亡逐渐与5-FU趋于一致。研究显示，Bcl-2和caspase 3是细胞凋亡研究中的关键蛋白，Bcl-2可抑制细胞凋亡，caspase 3可促进细胞凋亡，且该过程可被Bcl-2阻断[19]。本研究结果显示，干预3、7天时，5-FU组和氟尿嘧啶组细胞Bcl-2蛋白相对表达量均低于对照组细胞，caspase 3蛋白相对表达量均高于对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明氟尿嘧啶植入剂不仅可以上调caspase 3的表达，还可抑制Bcl-2蛋白的表达，具有启动Hela细胞凋亡程序的作用。

综上所述，氟尿嘧啶植入剂可能通过上调caspase 3的表达，下调Bcl-2的表达，从而抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，与促进细胞凋亡有关。