橙皮苷对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制

陈彤 班遵浦 罗国鸿 袁立英 廖效竹

(遵义市第一人民医院肾内科，贵州 遵义 563000)

肾脏缺血再灌注(I/R)损伤是引起急性肾损伤(AKI)的主要原因，常继发于肾脏移植、肾脏肿瘤切除术、肾动脉血运重建术等，与术后短期、长期生存率负相关〔1～4〕。橙皮苷(Hesp)具有抗凋亡、抗氧化应激等多重药理学功效，从而在肿瘤发生、缺血性神经元损伤、糖尿病心肌I/R损伤等多种病理过程中发挥保护功能〔5～7〕。研究证实，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)依赖性信号通路激活是Hesp发挥多种保护功能的关键分子机制〔8，9〕。然而，Hesp是否通过调控PI3K/AKT通路在肾脏I/R中发挥保护功能尚未阐明。本研究建立大鼠肾脏I/R损伤模型，拟观察Hesp对I/R肾脏的影响及其可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物：SD雄性大鼠(180～200 g，SPF级)由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。试剂与仪器：Hesp(纯度>98%)与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)均购自国药集团化学试剂有限公司；PI3K/AKT通路抑制剂(LY294002)购自美国Sigma公司；RNA引物、提取、反转录与扩增试剂盒购于TaKaRa公司；Bax、Bcl-2、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3/9抗体购于Abcam公司；磷酸化(p)-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购于Santa Cruz生物技术公司；超氧化物歧化酶(SOD)/丙二醛(MDA)分析试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒与电化学发光(ECL)试剂盒购自武汉碧云天生物技术研究所；TUNEL凋亡试剂盒购置Roche公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗由武汉三鹰生物技术提供。

1.2肾脏I/R损伤模型构建 参考文献〔10〕方法构建大鼠肾脏I/R损伤模型。1% 戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹正中切口后逐层分离腹膜暴露肾脏。钝性分离右侧输尿管并用5-0丝线结扎，结扎右侧肾蒂后取下右肾，腹腔内补充肝素(40 μl)抗凝。分离左侧肾脏后动脉夹夹闭左侧肾蒂诱导肾脏缺血，肾脏由鲜红色转为紫黑色代表缺血成功。缺血45 min后，松开动脉夹以恢复血流供应，肾脏由紫黑色转为鲜红色代表再灌注成功。再灌注24 h后，留取血液和肾脏标本进行下一步检测。假手术(SO)组大鼠除左侧肾蒂不夹闭外，其他处理方法同肾脏I/R(I/R)组。

1.3实验分组 SD大鼠随机分为3组(n=6)：SO组、I/R组和肾脏I/R+Hesp处理(I/R+Hesp)组。I/R+Hesp组在肾脏I/R术前连续3 d给予Hesp(200 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液)灌胃处理〔8〕；SO组与I/R组大鼠给予同等剂量0.5% CMC-Na。根据分组情况按上述方法构建肾脏I/R损伤模型。实验处理完成后，留取血液和肾脏组织标本进行病理及分子生物学检测等。为进一步探讨Hesp抑制肾脏I/R损伤的具体分子机制，给予LY294002(0.3 mg/kg)进行干预。SD大鼠随机分为4组(n=6)：I/R组；I/R+Hesp组；I/R+LY294002组；I/R+Hesp+LY294002组。根据分组情况，按上述方法给予Hesp预处理；I/R术前30 min 给予LY294002尾静脉注射。

1.4血清肌酐(Cr)与尿素氮(BUN)含量测定 参考文献〔1，2〕方法检测肾脏I/R损伤血清Cr与BUN含量。收集1 ml 血液标本，室温静置2 h后4℃离心10 min (3 500 r/min)。收取上清液后全自动生化检测仪(Dimension RXL Max，Siemens，Germany)检测Cr与BUN含量。

1.5苏木素-伊红(HE)与TUNEL染色 参考文献〔4〕方法，各组大鼠I/R左肾组织石蜡切片(厚度4 μm)，行常规HE染色，随机选取10个视野沿皮质到髓质方向在光学显微镜观察并拍片(400倍)，并根据肾小管上皮肿胀、间质水肿、小管间出血等损伤程度进行评分(0～4分)：0分，损伤范围<10%；1分，损伤范围10%～25%；2分，损伤范围26%～50%；3分，损伤范围51%～75%；4分，损伤范围>75%。此外，TUNEL染色按试剂盒操作说明进行，胞核黄染为阳性着色，凋亡指数=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.6MDA含量与SOD活性测定 参考文献〔1～3〕方法检测MDA含量及SOD酶活性。新鲜留取的肾脏标本匀浆、4℃离心10 min(3 500 r/min)后，收集上清液分别采用硫代巴比妥法(TBA)测定MDA含量、黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，分别在450 nm、530 nm波长处测定吸光度，计算SOD活性及MDA含量。

1.7Western印迹检测 参考文献〔1～4〕方法检测相关蛋白表达情况。取-80℃保存的肾脏组织，提取总蛋白并用BCA试剂盒测定蛋白浓度，10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，然后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，用Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3/9、p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT及GAPDH一抗4℃孵育过夜，二抗室温继续孵育1 h。ECL试剂盒显色，Image Lab软件分析目的条带与内参条带灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS16.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1Hesp改善I/R诱导的肾脏损伤 与SO组相比，I/R组Cr与BUN含量显著升高(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+Hesp组Cr、BUN水平明显降低(P<0.05)。HE染色显示I/R组肾小管上皮细胞坏死分离、基底膜暴露、间质充血及炎症细胞浸润，且与SO组比较病理损伤评分明显升高(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组Cr、BUN及肾小管损伤评分比较

与SO组相比：1)P<0.05；与I/R组相比：2)P<0.05；表2、3同

2.2Hesp抑制I/R诱导的凋亡与氧化应激反应 与SO组相比，I/R组Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达显著升高，Bcl-2表达显著降低(P<0.05)，凋亡率显著上调(P<0.05)，SOD活性显著降低，MDA含量显著升高(P<0.05)。与I/R组比较，I/R+Hesp组Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高，凋亡率显著降低，SOD活性显著升高，MDA含量显著降低(P<0.05)。见表2、表3、图2、图3。

2.3Hesp在肾脏I/R损伤中激活PI3K/AKT信号通路 与SO组相比，I/R组p-PI3K与p-AKT表达明显升高(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+Hesp组p-PI3K、p-AKT蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表3、图4。

2.4LY294002逆转Hesp对I/R肾脏的保护作用 与I/R组比较，I/R+Hesp组Cr、BUN蛋白表达及肾小管损伤评分均显著降低(P<0.05)。与I/R+Hesp组相比，I/R+Hesp+LY294002组血清Cr、BUN含量均明显升高并伴随肾小管损伤评分显著升高(P<0.05)。I/R+LY294002组与I/R+Hesp+LY294002组Cr、BUN含量及肾小管损伤评分差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表2 各组凋亡相关蛋白表达比较

表3 各组p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达及凋亡率比较

图2 各组TUNEL染色图(×400)

图3 Western印迹检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达

图4 Western印迹检测p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达

组别Cr(μmol/L)BUN(mmol/L)肾小管损伤评分(分)I/R组141.2±4.219.2±0.93.13±0.1I/R+Hesp组82.3±2.61)11.3±0.81)1.35±0.211)I/R+ LY294002组139.2±5.32)19.7±0.72)3.16±0.422)I/R+ Hesp +LY294002组140.1±5.12)19.8±1.92)3.13±0.052)

与I/R组相比：1)P<0.05；与I/R+Hesp组相比：2)P<0.05

3 讨 论

本研究结果表明，Hesp能够显著抑制I/R诱导的肾脏功能障碍及病理损伤，并在凋亡、氧化应激关键病理生理环节发挥作用。Hesp促进I/R肾脏PI3K/AKT信号通路激活，而抑制PI3K/AKT可逆转Hesp的肾脏保护功能。以上结果表明，Hesp主要通过PI3K/AKT依赖性途径在肾脏I/R凋亡与氧化应激关键致病环节发挥保护功能。

近年来，Hesp在I/R损伤中的保护作用日益得到关注，针对其有效干预时间探讨也持续进展〔5～7〕。Gandhi等〔11〕在心肌I/R损伤中研究发现：Hesp预处理(15 d)能够显著降低心肌梗死面积。在Hesp对糖尿病心肌I/R损伤的干预实验中观察到，连续2 w Hesp预处理可以减轻糖尿病心脏I/R损伤，减小心肌梗死面积〔6〕。Li等〔8〕进一步观察了短期(3 d)Hesp预处理对心肌I/R损伤的影响，发现其能够改善心脏病理损伤，抑制炎症、凋亡与氧化应激等多重致病环节。然而，Hesp对肾脏I/R损伤是否有保护功能尚无相关研究佐证。与以上研究结果一致，本研究在肾脏I/R损伤中观察到Hesp(3 d)预处理对肾脏功能、结构及凋亡、氧化应激反应具有明显的干预作用。因此，结合既往研究证据，短期或长期Hesp处理对I/R损伤具有显著疗效，同时本研究也进一步拓展了Hesp的药理学功效，为临床防治肾脏I/R损伤提供了理论依据和有效的策略。

肾脏I/R损伤的发生机制复杂，凋亡级联及氧化反应过度激活是其主要病理生理改变。其中，前者以促凋亡分子Bax、凋亡执行蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3上调并伴随抗凋亡分子Bcl-2表达下调为主要表现，而氧化应激反应中抗氧化应激酶SOD活性降低并伴随氧化应激代谢产物MDA含量上调〔1～4〕。既往研究表明，PI3K/AKT信号通路激活是肾脏I/R损伤中的关键内源性保护机制，其主要通过影响下游多重效应分子〔如血红素氧合酶(HO)-1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、转录因子NF-E2相关因子(Nrf)2等〕调控凋亡、氧化应激等主要病理损伤过程〔10，12〕。Liu等〔2〕研究发现，Kappa型阿片受体(KOR)介导的PI3K/AKT/eNOS激活能够有效减轻I/R诱导的凋亡与氧化应激反应，且其肾脏保护功能可以被PI3K/AKT抑制剂显著逆转。Zhang等〔12〕在肾脏I/R损伤中证实，Tempol 诱导PI3K/AKT/Nrf2信号通路激活能够抑制cleaved caspase-3表达，并调控SOD/MDA改变，从而减轻凋亡与氧化应激反应的发生。以上结果表明，选择性干预PI3K/AKT依赖性途径是防治肾脏I/R的有效途径。值得注意的是，Hesp具有激活PI3K/AKT通路的药理活性，并构成抑制I/R或缺氧复氧损伤的主要分子机制〔9〕。基于以上研究结果，本研究猜测Hesp也可能通过PI3K/AKT依赖性途径在肾脏I/R中发挥保护功能。本研究结果表明，I/R诱导p-PI3K/AKT激活在Hesp干预后进一步上调，并伴随凋亡与氧化应激反应的下调；而特异性抑制PI3K/AKT通路后，Hesp的肾脏保护功能被明显抑制。既往研究联合本实验证据为Hesp减轻肾脏I/R损伤增加了新的理论依据和潜在干预靶点，通过Hesp途径靶向调控PI3K/AKT可能为防治肾脏I/R损伤提供有效途径。此外，鉴于Hesp在调控多种信号通路〔如 Janus激酶(JAK)2/转录激活因子(STAT)3、Wnt/β-catenin通路等〕中的药理学活性〔13，14〕，其肾脏I/R抑制功能是否依赖性于其他分子机制仍需进一步研究。