老年冠状动脉严重狭窄患者血浆miRNA-195表达及其与侧支循环形成的关系

卢辉耀 许朝祥 徐训发

(福建医科大学附属第二医院心血管内科，福建 泉州 362000)

冠心病是一种不可逆的慢性病，主要是由冠状动脉血管动脉粥样硬化而引起的血管腔狭窄或阻塞〔1〕。冠状动脉狭窄程度相近的冠心病患者的临床症状及远期预后差异较大，这可能与冠状动脉侧支循环密切相关〔2〕。冠状动脉侧支循环是心肌在长期缺血缺氧的基础上形成的代偿机制，可起到保护心室功能的作用〔3〕。微小RNA(microRNA)是近年来发现的一类长度为18～24个核苷酸的内源性小RNA，在多种组织中均有表达〔4〕。miRNA-195是microRNA的一个重要类型，既参与细胞缺氧的调控，也参与机体固有免疫的调节〔5〕，研究表明其与血管内皮细胞的存活和分化具有相关性〔6〕，但miRNA-195与老年冠状动脉严重狭窄患者侧支循环的形成报道较少。本研究探讨老年冠状动脉严重狭窄患者血浆miRNA-195的表达及其与侧支循环形成的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2014年4月至2017年10月福建医科大学附属第二医院收治的68例老年冠心病患者纳入老年冠心病组，入组患者均经冠状动脉造影检查，存在左前降支、左回旋支、右冠状动脉单支且冠状动脉狭窄程度达95%以上。排除合并急性心肌梗死者、冠状动脉心肌桥者、先天性冠状动脉畸形者、血液系统疾病者、严重肝肾功能不全者、有经皮冠状动脉介入治疗史者及冠状动脉旁路移植术者。根据Rentrop分级将患者分为侧支良好亚组(Rentrop分级≥2)32例和侧支不良亚组(Rentrop分级≤1)36例。侧支良好亚组男18例，女14例，年龄65～80岁，平均(71.73±6.58)岁，Gensini积分(110.96±34.72)分；侧支不良亚组男21例，女15例，年龄65～80岁，平均(72.24±7.32)岁，Gensini积分(63.19±22.04)分。另将同期到福建医科大学附属第二医院体检的72例体检健康者纳入对照组，其中男39例，女33例；年龄65～80岁，平均(71.26±6.67)岁。老年冠心病组和对照组的性别、年龄比较差异无统计学意义(P<0.05)。本研究经福建医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准，研究对象及其家属在参与研究前均知情同意，并签署知情同意书。

1.2样本采集 老年冠心病组于冠状动脉造影术前抽取患者空腹静脉血5 ml；对照组于体检当日清晨抽取空腹静脉血5 ml，均置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，经离心处理后取上清液存于-20℃冰箱中待检。

1.3试剂与仪器 逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒由美国ABI公司提供；TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司；人血管内皮生长因子酶联免疫分析试剂盒购于美国R&D公司；7500型RT-PCR仪由美国ABI公司提供；分光光度计购于Bio-Rad公司；离心机购于美国Thermo公司。

1.4血浆中miR-195的测定 ①总RNA提取：取2 ml血浆样本按TRIzol试剂盒说明书提取样本中总RNA，0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，采用Bio-Rad检测RNA纯度及浓度，另取1 μl RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，将电泳条带清晰者用于RT-PCR检测。②逆转录反应：按照逆转录试剂盒操作说明书进行逆转录反应，反应体系为20 μl，于0.1 ml EP管中分别加入10×RT缓冲液1.5 μl、1 μmol/L逆转录特异性引物3 μl、100 mmol/L脱氧核苷酸(dNTPs) 0.15 μl、20 U/μl RNA酶抑制剂0.19 μl、50 U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μl、RNA样品1 μl，然后加DEPC水补至20 μl。反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 s，反应后产物置于-20℃保存。miR-195逆转录引物序列：5′-TCTCACTGTGTCCGTAAAGTCGGCAACATTGCCGTTTCGCACTC-3′；U6逆转录引物序列：5′-CTCTGCAAACGTGCGTTTGTCCA-3′。③RT-PCR反应：按照PCR试剂盒操作说明书进行操作，反应体系为20 μl，包括逆转录产物cDNA 1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix 10 μl、引物1 μl、双蒸水8 μl。反应条件：95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。采用2-△△CT方法计算miR-195表达水平，以U6为内参，ΔCt值=miR-195Ct值-U6Ct值。miR-195引物序列：正向5′-TCTCACCATGCAAATGCGGGTCATTTAGGA-3′，反向5′-GGTAGTGCAGGTAGTG-3′；U6引物序列：正向5′-CCTGCGGCTTCTGACCT-3′，反向5′-CGAACCTTAAACGTGCTTGT-3′。

1.5血浆中血管内皮生长因子(VEGF)的测定 取2 ml血浆样本应用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测患者血清中VEGF的浓度，分别设置标准孔(加入标准品50 μl)、待测样品孔(先加入样品稀释液40 μl，再加入待测样品10 μl)及空白孔(不加样品及酶标试剂)，封板后常温(37℃)孵育30 min，然后重复洗涤5次，再向标准孔和待测样品孔各加入50 μl酶标试剂，然后在进行常温孵育及洗涤(步骤同上)，然后再加入显色剂、终止液，测量三个孔的吸光度，并于加入终止液15 min内测定VEGF水平。

1.6统计学分析 采用SPSS18.5软件进行χ2检验，t检验，Pearson直线相关分析，Logistic回归分析，采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血浆miRNA-195水平对冠状动脉侧支循环形成的辨别能力。

2 结 果

2.1两组血浆中miRNA-195及VEGF水平比较 老年冠心病组血浆中miRNA-195及VEGF表达水平均明显低于对照组(t=5.978、4.871，均P=0.000)，其中侧支不良亚组明显低于侧支良好亚组和对照组(t=8.662、11.204，P=0.000；t=7.961、10.812，均P=0.000)，见表1。

表1 两组血浆中miRNA-195及VEGF水平比较

与对照组比较:1)P<0.05；与侧支良好亚组比较:2)P<0.05

2.2血浆miRNA-195表达与老年冠状动脉严重狭窄患者侧支循环的相关分析 血浆miRNA-195表达水平与老年冠状动脉严重狭窄患者侧支循环呈正相关(r=0.615，P=0.003)，侧支循环良好者的血浆miRNA-195水平相对较高。

2.3影响老年冠状动脉严重狭窄患者侧支循环的因素分析 多因素Logistic回归分析提示，血浆miRNA-195水平和Gensini积分是影响老年冠状动脉严重狭窄患者侧支循环的危险因素，见表2。

2.4血浆miRNA-195表达对冠状动脉侧支循环形成的辨别能力分析 以血浆miRNA-195表达水平作为检验变量，以是否形成冠状动脉侧支循环为状态变量制作ROC曲线，由ROC曲线可知，血浆miRNA-195判断老年冠状动脉严重狭窄患者侧支循环形成的灵敏度为83.28%，特异度为94.75%，见图1。

表2 影响老年冠状动脉严重狭窄患者侧支循环的因素分析

图1 血浆miRNA-195相对表达量的ROC曲线图

3 讨 论

miRNA广泛存在于真核生物中，其主要以基因簇、单拷贝或多拷贝等形式存在〔7〕。miRNA可直接参与调节血管生成，还可对促血管生成因素进行调节，从而起到调节血管生成的作用〔8，9〕。既往研究报道，有多种miRNA在动脉粥样硬化发展中起到关键作用〔10〕，其中miRNA-21、miRNA-16、miRNA-214等呈高表达〔11，12〕，miRNA-145、miRNA-222呈低表达〔13，14〕。miRNA-195是miRNA的一个重要类型，参与细胞缺氧的调控，也参与机体固有免疫的调节，以往的研究表明其与血管内皮细胞的存活和分化具有相关性〔15〕。VEGF在内皮细胞的增殖及迁移中起到促进作用，是一种重要的血管生成调节因子〔16〕。当出现心肌缺血时，一方面可诱发机体炎症反应，大量炎性因子的释放可引起血管内皮细胞功能异常，进而影响VEGF的分泌〔17〕；另一方面会出现心肌重塑而引起miRNA表达水平发生改变〔18〕。

本研究结果提示miRNA-195及VEGF可能与老年冠心病的发生发展密切相关。王文峰等〔19〕研究报道显示，miRNA-195与心血管疾病的发生发展存在相关性，可能为该类患者的临床治疗提供新思路。

本研究结果提示miRNA-195在冠状动脉严重狭窄侧支循环形成中发挥重要作用，可作为辨别侧支循环形成的评价指标之一。侧支循环的建立利于缓解患者心肌缺血症状，可缩小心肌梗死范围，减少心绞痛发作风险，利于患者预后。张娴等〔20〕研究报道，miRNA-195可通过促使VEGF的大量释放，进而促进冠状动脉狭窄侧支循环的建立，这与本研究结果一致。