升麻对牙菌斑主要组成链球菌的体外抑菌活性研究

梁 婕 曾敏敏 郑晨韵 陈深元 陈锡姣 杨雪琼 龚道元 陈 鑫

佛山科学技术学院口腔医药工程学院，广东省佛山市 528000

龋病和牙周病是人类常见的口腔疾病之一，龋病和牙周病发生的始动因子是牙菌斑。牙菌斑是附着于牙面、牙间或修复体表面的细菌性生物膜，容纳了各种需氧菌、厌氧菌。人类牙菌斑中厌氧链球菌占大多数，其中变异链球菌、唾液链球菌、轻型链球菌和血链球菌在牙菌斑厌氧链球菌中占比较大，而变异链球菌更是致龋优势菌。因此抑制牙菌斑主要组成链球菌有机会抑制牙菌斑的形成，从而有效预防龋病和牙周病[1]。

升麻作为一种传统中药，在临床上常常被用于预防及治疗口腔疾病，通过查阅有关的中医古文记录，也发现古人在治疗口腔疾病过程中也使用了升麻这种中药。升麻具有良好的抗炎镇痛解毒作用，其成分含具有抗菌作用的乙酯[2]。中药在我国来源丰富，副作用较小，寻找安全有效的防龋药物是学者研究的热点。

目前国内外针对中药对口腔致病菌的研究很多，研究对象大部分主要为有明确抗菌作用的中药[3-4]，而升麻作为一种可治疗口腔疾病的传统中药，其对口腔致病菌作用的研究十分有限。根据有关升麻对口腔致病菌的最新研究进展，可确认升麻辅助五倍子等中药的使用可对变异链球菌等有抑制作用。

因此本课题将研究升麻对4种牙菌斑主要组成链球菌的体外抑制活性，以期望可进一步的研究升麻是否具有抑制牙菌斑形成的活性，从而有效的预防龋病或牙周病。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、培养基及药物:变异链球菌(Streptococcusmutans)ATCC25175、血链球菌(Streptococcussanguinis)ATCC49295、唾液链球菌(Streptococcussalivarius)ATCC7073及乙型溶血链球菌(β-Hemolyticstreptococcus)CMCC32210均购于北纳生物，BHI液体培养基购于；升麻购于佛山市北京同仁堂。

1.1.2 试剂及仪器：75%乙醇、厌氧袋、96孔板、恒温培养箱、回流仪器、粉碎机、移液枪。

1.2 方法

1.2.1 药品制备：升麻于2017年11月于佛山北京同仁堂购入。将100g升麻粉碎，用药重量6～14倍量体积的75%乙醇回流提取3次，每次回流2h，合并提取液，减压浓缩成150ml的提取液[3]。取6管1ml的升麻提取液干燥后可得6管提取物，重量如表1。通过表1的数据计算可知升麻提取液的浓度约为13.5mg/ml,将提取液稀释到10mg/ml作为抑菌试验的母液。

表1 升麻提取液干燥后提取物重量

1.2.2 菌悬液的配制：将各菌株复苏48h后，分别接种于BHI琼脂培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24h。取细菌接种于BHI液体培养基配成0.5麦氏单位的菌液(1.5×108/ml)，用BHI液体培养基稀释1 000倍成试验用的菌悬液。

1.2.3 最小抑菌浓度的测定：采用微量肉汤稀释法。取96孔板在每一排最左侧标记4种链球菌的名称，以一排为例，将从左往右数第11孔用作“BHI液体培养基+菌阳性对照”，标记为“+”，第12孔标记为“BHI液体培养基阴性对照”，标记为“-”。在第1孔加入升麻提取液(10mg/ml)200μl，在第2～12孔每孔均加入BHI液体培养基100μl。使用移液枪从第1孔中取100μl提取液至第2孔，混匀，依次进行到第10孔，弃去100μl混合液，达到倍比稀释药物提取液的目的，使1～10孔的药物浓度分别为5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.312mg/ml、0.156mg/ml、0.078mg/ml、0.039mg/ml、0.019 5mg/ml、0.001mg/ml。诸如此类，4种细菌使用4排孔进行试验。每排的第1～11孔加入与各排标记的细菌名称所对应的菌悬液100μl，最后将该96孔板置于37℃恒温培养箱中培养18～24h，重复试验3次，观察现象，以肉眼所见微孔内能完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药物对受试菌的MIC。

2 结果

升麻提取液对4种细菌的抑制活性。经过3次独立重复试验，测得4种牙菌斑主要组成链球菌对升麻提取液中的MIC及其平均值见表2；可看出升麻提取液对牙菌斑的几种主要组成链球菌都有抑菌作用，其中对变异链球菌和唾液链球菌的抑制作用最为明显，MIC可以达到0.2mg/ml左右，明显优于对乙型溶血链球菌和血链球菌的作用，后两者MIC均>1mg/ml。

表2 升麻对牙菌斑4种主要组成链球菌的最小抑菌浓度MIC(mg/ml)

3 讨论

牙菌斑生物膜是龋病和牙周病的始动因子，而龋病和牙周病正是人类最普遍的两种口腔疾病。本次研究的4种链球菌为牙菌斑生物膜种几种常见链球菌，其中变异链球菌和血链球菌对维持牙菌斑的生态平衡有着非常重要的作用，变异链球菌通过产生胞外多糖粘附在光滑的牙面上，它的产酸性和耐酸性更使其成为重要的致龋菌[5]。乙型溶血性链球菌致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。因此，以这4种链球菌作为研究针对抑制牙菌斑形成或防龋药物的实验菌种，具有实际意义。早期抗生素被用于预防或辅助治疗龋病和牙周病，但长期使用抗生素可引起口腔菌群生态平衡失调，从而导致其他疾病。近年来研究发现，口腔细菌的耐药性和细菌检出率有逐年上升的趋势[6]。故寻找毒副作用小的新药物是非常必要的。非常多的中国传统中草药有清热解毒、抑菌杀毒的作用，并且毒副作用小[7]。若能选出一种具有抑制这4种牙菌斑主要链球菌的中草药，将可为延缓或抑制牙菌斑的形成提供一种重要方式。升麻具有清热解毒、抗癌抗氧化的作用，升麻提取物具有较好的杀菌活性。升麻作为一种常用中草药，自古以来便被用于治疗口腔疾病。郑雅楠[8]使用升麻提取物等制作了用于防治牙周病的口腔护理液。王记祥等[9]通过回流提取升麻根茎中的化合物进行抑菌实验，发现其中25-O-乙酰升麻醇、兴安升麻苷C和β-谷甾醇共3种化合物具有较好的抗菌活性。胡桂清、李建志等[4，7]发现升麻对金黄色葡萄球菌、埃希大肠杆菌等具有明显抑菌作用。但有关升麻对口腔细菌的研究甚少，近几年才开始开展研究，刘玉梅[10]发现五倍子和升麻配伍使用可抗龋病相关的口腔致病菌，胡小艳[11]发现升麻对牙龈卟啉单胞菌具有较强的抑制活性。可见升麻具有较好的抑菌特性，并且对某些口腔致病菌具有良好的抑制活性。本研究以升麻提取液作为实验试剂，来对4种组成牙菌斑的链球菌的抑制活性，研究结果证实了升麻对变异链球菌和唾液链球菌有显著的抑制作用，最小抑菌浓度可达0.21mg/ml；对血链球菌和乙型溶血性链球菌有较好的抑菌浓度，最小抑菌浓度可达1.67mg/ml。升麻在我国应用广泛，具有毒副作用小、资源丰富、成本不高等优点，本次研究结果表明升麻对4种牙菌斑主要组成的链球菌有良好的抑制活性，其作为防治龋病或牙周病的药物具有巨大的开发潜力。但牙菌斑的形成是一个复杂的过程，龋病和牙周病也是多因素引起的疾病，仅仅研究药物对某几种特定的细菌的抑制活性并不能证明其具有作为药物的价值。不同提取方法对升麻提取物的影响、长期使用升麻对口腔菌群生态平衡的影响，抑制这4种链球菌是否对牙菌斑的形成具有抑制作用，这些问题都需要再进一步的探索与研究。