构建脓毒症大鼠ICU获得性衰弱模型的研究

唐 章，徐朝霞，李 亚，朱忠立，宋羽希，向朝雪，李福祥

危重症患者无明确病因出现骨骼肌变性或（和）外周神经损伤，并由此产生的一系列临床表现被称之为ICU获得性衰弱(ICU-AW)。研究显示，该病的发生与脓毒症、机械通气、长时间制动、高血糖状态、激素及神经肌肉阻滞剂应用等因素有关[1]。随着重症监护理念的发展，呼吸机的广泛使用，ICUAW的发病率也随之增加。然而，目前对于该病的诊治仍未形成完善的临床指南，制约该病研究的关键在于目前仍未有一种契合该病发病机制的实验动物模型构建方法。本研究拟通过对脓毒症大鼠进行制动来构建一种简便、易行的ICU-AW大鼠模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 10 w龄、体重393～421 g健康雄性SPF级SD大鼠[成都达硕公司，生产许可证号：scxk（川）2008-24]。 脂多糖内毒素(LPS，北京索莱宝公司)，Atrogin-1引物、Murf1引物（成都擎科梓熙公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备[2]实验大鼠72只，随机分成 12 组（对照 3、6、9 d 组；制动 3、6、9 d 组；LPS 3、6、9 d 组；LPS 加制动 3、6、9 d 组），各 6 只。 大鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 ml/kg)全身麻醉后称重，LPS组和LPS+制动组一次性腹腔注射LPS 5 mg/kg，对照组和制动组腹腔注射等体积生理盐水。随后将制动组和LPS+制动组大鼠持续固定于大鼠固定器制动至各分组时间点。对照组和LPS组置于鼠笼内，各实验鼠仅每天喂服葡萄糖氯化钠溶液(5 ml/kg·h)，置于动物房，保持室温24～30℃左右，24 h通风排气。

1.2.2 标本制备 分别于分组后3、6、9 d处死各组相应时间点大鼠，再次称重。留取大鼠膈肌和双侧腓肠肌，将所取标本一部分放入10%甲醛中24 h以上，剩余部分标本放置于-80℃冰箱。

1.2.3 观察指标 组织形态学观察：取上述经甲醛固定的膈肌、腓肠肌组织标本，浸蜡包埋，以厚度4 mm切片，脱蜡、至水、苏木素染色5 min；自来水冲洗，盐酸乙醇溶液分化30 s，于伊红溶液中2 min；脱水、透明、封片。每个标本于200倍光镜下至少观察5个切片，采用IPP6.0图像分析软件测定肌纤维横径，每张切片测5个视野，取平均值。

RT-PCR法检测Atrogin-1和Murf1基因表达量：将研钵放置于冰上预冷，从-80℃冰箱中分别取出l00 mg腓肠肌和膈肌标本，放入研钵内，加入液氮反复磨细，加入1 ml Trizol充分匀浆，分别将腓肠肌和膈肌转移至0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理后的EP管内，加入 0.2 ml氯仿，剧烈振荡 15 s，12 000 r/min，离心（4℃）15 min，取上清液；加入异丙醇 0.5 ml，充分混匀，于室温 10 min，12 000 r/min，离心（4℃）10 min；弃上清液，加入1 ml 75%乙醇，洗涤沉淀，7500 r/min，离心（4 ℃）10 min；弃上清液，晾干，加入适量的DEPC H2O溶解。按照Akkad等[3]的基因序列设计引物，由成都擎科梓熙公司合成该引物，引物系列 ：Atrogin-1:5'-TCCTGGATCCAGAAGATTCA AC-3'(上 游)，5'-TCAGGGATGTGAGCTGTGACTT-3'(下游);Murf1:5'-ACCACCTCTGCCGGAAGTGT-3'(上游)，5'-CCGCGGTTGGTCCAGTAG-3'(下游)。 两步法PCR扩增测量Atrogin-1和Murf1基因表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析，符合正态分布计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间点体重比较 在各分组时间点，LPS+制动组体重均明显低于其他3组（P＜0.05，表 1）。

表1 各组间不同时间点体重比较（n=6）

2.2 各组腓肠肌和膈肌组织形态学比较 在各分组时间点，LPS+制动组腓肠肌和膈肌纤维较其他各组明显萎缩，且伴有纤维间隔不同程度增宽（图1）。

图1 各组腓肠肌形态学结构（HE染色，×200）

2.3 各组腓肠肌和膈肌纤维横径比较 对照组各时间点腓肠肌和膈肌纤维横径比较无显著差异（P＞0.05），而其他3组均随时间延长而逐渐减小；在各分组时间点，LPS+制动组腓肠肌、膈肌纤维横径均明显小于其他3组（P＜0.05，表2）。

2.4 各组腓肠肌和膈肌Atrogin-1和Murf1 mRNA相对表达量比较 在各分组时间点，LPS+制动组腓肠肌、膈肌Atrogin-1、Murf1 mRNA相对表达量均明显高于其他 3组（P＜0.05）。 见表 3、4。

图2 各组膈肌形态学结构（HE染色，×200）

表2 各组腓肠肌和膈肌纤维横径比较（n=6）

表3 各组腓肠肌Atrogin-1mRNA和Murf1?mRNA相对表达量比较（n=6）

表4 各组膈肌Atrogin-1mRNA和Murf1?mRNA相对表达量比较（n=6）

3 讨论

ICU-AW可分为多发性肌病、多发性神经病及多发性神经肌病3种亚型[4]，而临床常见为多发性肌病，因此，大多数研究均以该亚型建模。常用的建模方法有脓毒症法、悬吊法、机械通气法、激素诱导法等，但每种方法均存在不同缺点，故上述方法均未得到普及[5]。文献显示，脓毒症不仅会导致实质器官功能衰竭，还可以造成周围神经和骨骼肌损伤[6]。此外，制动（特别是长时间制动）是导致ICU-AW的另一重要原因[7]。因此，本研究在既往基础上，兼顾可行性和临床发病特征，采用LPS加制动建模。

病理检查发现肌纤维萎缩和神经轴突变性仍是目前确诊本病的标准，但上述改变在发病早期并不明显。而研究显示，Murfl和Atrogin-1作为泛素-蛋白酶体途径中两个重要的特异性肌肉萎缩指标，参与了泛素化过程[8]；由各种疾病所致骨骼肌萎缩中，都可以观察到它们的特异性表达，故将其作为ICU-AW动物建模的早期观察指标[9]。

本研究结果提示，LPS+制动组大鼠相比较其他各组大鼠体重明显下降，腓肠肌和膈肌纤维横径明显减小，且随着实验时间的延长，这一效应越显著，说明LPS+制动组大鼠较其他组大鼠发生了骨骼肌萎缩。另外，在制动组大鼠中，腓肠肌纤维横径较对照组和LPS组明显下降，说明制动在肢体肌肉萎缩上发挥着重要的作用，这可能是废用性肌萎缩改变所致。而LPS组大鼠膈肌纤维横径较对照组和制动组明显下降，说明脓毒症状态对膈肌萎缩也有一定影响，但其机制有待进一步研究。在Atrogin-1、Murf1基因表达上，LPS+制动组大鼠较其他各组显著增强。不仅如此，还发现Atrogin-1、Murf1基因表达是发生在建模的早期阶段，并随着实验时间延长，表达量增多，说明泛素-蛋白酶体途径参与了多发性肌病的发病过程，且其特异性标记物的产生是先于形态学改变的，那么是否可以将此类标记物用于多发性肌病的早期诊断，仍需实验验证。

综上所述，腹腔注射LPS加制动可作为构建ICU获得性衰弱大鼠模型的方法，且该方法简便、易行，同时符合ICU-AW发病机理，可用于ICU-AW发病机理、治疗等的实验研究。