过渡金属离子与牛血红蛋白的相互作用*

2019-06-27聂志颖陈佳璐赵玉玲

浙江师范大学学报（自然科学版） 2019年3期

聂志颖，陈佳璐，冯洁，赵玉玲

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004；2.浙江师范大学 “先进催化材料”教育部重点实验室，浙江金华 321004)

血红蛋白(Hb)由含有亚铁离子和吡咯环的血红素组成[1]，在体内主要发挥输氧储氧功能，这些功能与血红素中的亚铁离子(Fe2+)关系密切.血红素依靠范德华力与周围的疏水性氨基酸残基保持空间构象，金属离子既可与血红蛋白残基上的N，O或S结合，又可取代血红素上的Fe2+，引起血红蛋白结构的改变[2].牛血红蛋白(BHb)同源于人血红蛋白，经常被作为模型蛋白使用.研究发现，铬(VI)酸根离子依靠氢键和范德华力使部分血红素辅基从BHb空腔中脱离[3]，[Hg(SCN)4]2-则通过静电引力和疏水作用力与血红蛋白反应[4].上述作用均可导致血红蛋白构象发生改变，影响血红蛋白的功能.

过渡金属铁、钴、镍、铜在元素周期表中居于相邻位置，是维持生物体正常生理功能所必需的微量元素.Cu2+参与维持铁的代谢平衡，Ni2+和Co2+参与体内血红蛋白的合成.病理条件下，生物体内过渡金属离子的浓度会升高，破坏血红素的结构，影响血红蛋白的功能.在模拟生理条件下，用紫外可见吸收光谱和荧光光谱研究了Cu2+，Ni2+，Co2+与BHb的相互作用，讨论了过渡金属离子与BHb的荧光猝灭作用，得到了过渡金属离子与BHb的表观结合常数、作用位点和作用方式，探讨了过渡金属离子对BHb蛋白质结构的影响，为研究金属离子对血红蛋白性能的影响提供一定的理论基础.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

普析TU-1810 PC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；F7000荧光分光光度计(日本日立公司)；ME-T分析天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；艾本德移液器(艾本德(上海)国际贸易有限公司).

牛血红蛋白(BHb)和三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)购自华美生物工程公司；醋酸铜(Cu(Ac)2)、醋酸镍(Ni(Ac)2)和醋酸钴(Co(Ac)2)购自阿拉丁公司；其他试剂均为分析纯试剂，使用前均未作进一步处理.

1.2 实验内容

1.2.1 溶液准备

精确配制50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH≈7.0，含100 mmol/L NaCl)；精确称量BHb，Cu(Ac)2，Ni(Ac)2和Co(Ac)2，加水溶解，在容量瓶中定容，4 ℃避光存放.

1.2.2 过渡金属离子对BHb紫外可见图谱影响

在5 mL比色管中加入相同量的Tris-HCl缓冲溶液和BHb储备液，依次加入不同浓度Cu2+，Ni2+和Co2+溶液，摇匀，在37 ℃水浴中温浴30 min，以Tris-HCl为参比液，扫描200～700 nm紫外可见吸收光谱.

1.2.3 过渡金属离子对BHb荧光图谱的影响

在5 mL比色管中，依次加入Tris-HCl缓冲溶液、BHb储备液和不同浓度Cu2+和Ni2+溶液，以缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，静置反应5 min.分别测定280～560 nm范围内，不同温度(298 K和308 K)的荧光光谱及过渡金属离子的吸收光谱.测定中通过固定BHb的浓度从而改变过渡金属离子的浓度.

2 结果与讨论

2.1 过渡金属离子与BHb相互作用的紫外可见图谱分析

2.1.1 过渡金属离子与BHb相互作用的紫外可见图谱

280 nm附近的吸收为BHb中芳香族氨基酸共轭键导致的紫外吸收，405 nm附近的吸收为血红素铁中π～π*跃迁导致的Soret带吸收.过渡金属离子在280 nm和405 nm均无吸收.文中主要研究Cu2+，Ni2+和Co2+对Soret吸收带的影响，因此仅观察过渡金属离子加入后405 nm附近BHb吸收光谱的变化.

由图1可见，过渡金属离子可降低BHb在405 nm附近的吸收峰强度，且有轻微蓝移.其原因可能是，Cu2+，Ni2+和Co2+进入BHb中血红素辅基的疏水空腔，通过置换反应部分取代Fe2+，形成血红蛋白衍生物，导致Soret带吸收强度降低.金属离子浓度越大，对BHb中π～π*跃迁的破坏越大.当金属离子与BHb物质的量浓度比达到10∶1时(此时金属离子终浓度为40 μmol/L)，Cu2+，Ni2+和Co2+导致Soret带吸收的降低值分别为7.9 %，7.3 %和6.9 %，即Cu2+与BHb的相互作用最强.

金属离子的浓度从a到g依次为0，4，8，16，24，32，40 μmol/L

2.1.2 过渡金属离子与BHb相互作用机理初探

亚铁血红素以Fe2+为中心，形成6配位的正八面体弱场.晶体场稳定化能(crystal field stabilization energy,CFSE)是影响八面体配合物稳定性的主要因素，CFSE的大小与d电子数的关系见图2.Cu2+，Ni2+，Co2+，Fe2+的d电子数分别为d9，d8，d7，d6，由图2知CFSE的大小依次为CFSE(Fe2+)>CFSE(Cu2+)>CFSE(Co2+)>CFSE(Ni2+).CFSE越小，中心离子所形成的配合物越稳定.因此，血红素金属配合物的稳定顺序可能为血红素镍>血红素钴>血红素铜>血红素铁.也就是说，Cu2+，Ni2+和Co2+均可置换血红素中的Fe2+，血红素镍配合物更稳定.

但图1的紫外可见图谱显示血红素铜配合物更稳定.通过欧文-威廉姆斯(Irving-Williams)稳定性顺序[5-6]和姜-泰勒(John-Teller)效应[7-9]对这一看似矛盾的现象进行解释.依据欧文-威廉姆斯序列(Mn2+

图2 八面体弱场中CFSE与d电子数的关系

2.2 过渡金属离子与BHb相互作用的荧光光谱分析

2.2.1 过渡金属离子与BHb相互作用的荧光光谱

固定激发波长为280 nm，过渡金属离子在300～500 nm范围内不发射荧光，BHb具有330 nm附近的内源荧光.固定温度分别为298 K和308 K时，发现过渡金属离子均导致BHb在330 nm附近的荧光产生有规律的猝灭，且轻微蓝移.笔者仅展示在308 K时的荧光光谱(见图3).

金属离子的浓度从a到f依次为0，8，16，24，32，40 μmol/L

2.2.2 过渡金属离子导致BHb荧光猝灭的机理研究

荧光物质分子(荧光体)与不发荧光的金属离子或小分子(猝灭体)相互作用，导致荧光物质的荧光强度降低，称为荧光猝灭.荧光体与猝灭体发生碰撞导致动态猝灭，荧光体与猝灭体生成不发荧光的基态复合物导致静态猝灭.通常假设为动态猝灭，则服从动态猝灭方程(Stern-Volmer，斯特恩-沃尔默)[10-11]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KD[Q].

其中：F0为BHb的荧光强度；F为加入金属离子后BHb的荧光强度；Kq为双分子猝灭常数；[Q]为金属离子的浓度；τ0为生物体的荧光寿命；KD为斯特恩-沃尔默常数.以F0/F为纵坐标，[Q]为横坐标，可求出直线斜率KD(见表1).生物体的平均荧光寿命大约为10-8s[12]，据此求出Kq(见表1).当Kq>2.0×1010L·mol-1·s-1时认为是静态猝灭[12]，导致荧光体荧光强度降低.由表1可知，Cu2+和Ni2+导致BHb荧光猝灭的Kq大于2.0×1010L·mol-1·s-1，说明金属离子对BHb荧光猝灭是形成基态复合物所引起的静态猝灭.

表1 过渡金属离子与BHb相互作用的动态猝灭常数(KD)和双分子猝灭常数(Kq)

金属离子T/K斯特恩-沃尔默常数KD/(L·mol-1)猝灭常数Kq/(L·mol-1·s-1)Cu2+2984.61×1034.61×10113084.33×1034.33×1011Ni2+2981.93×1031.93×10113083.29×1033.29×1011

2.2.3 过渡金属离子与BHb结合常数和结合位点

假设小分子在蛋白质上有n个相同且独立的结合位点，按照公式[13-14]：

lg(F0-F)/F=lgKA+nlg[Q].

其中：KA为金属离子与蛋白质的结合常数；n为结合位点数.以lg(F0-F)/F为纵坐标，lg[Q]为横坐标，代入最大荧光发射峰处(330 nm)的荧光强度，由直线截距和斜率求出结合常数KA、结合位点数n及相关系数(见表2).

表2 过渡金属离子与BHb相互作用的结合常数和结合位点

金属离子T/K结合常数KA/(L·mol-1)结合位点n相关系数Cu2+2981.460×1041.1670.999 73081.070×1041.1400.998 7Ni2+2981.040×1030.9370.998 43080.615×1030.8330.999 8

从表2可知，在所选温度下，Cu2+和Ni2+均以1∶1的物质的量之比与BHb形成静态复合物.在相同温度下，Cu2+所形成的静态复合物的结合常数最大，也进一步证实了血红素铜配合物最稳定(见图1).

2.2.4 过渡金属离子与BHb相互作用时的距离

金属离子与BHb中色氨酸残基相互作用时的结合距离可通过福斯特(Forster)共振能量转移理论进行计算[10].能量转移效率E、受体与荧光体结合距离r以及转移效率为50%时的临界距离R0可通过下列公式[11]计算：

J=[∑F(λ)·ε(λ)·λ4Δλ]/[∑F(λ)·Δλ].

其中：K2(K2=2/3)为取向因子；N(N=1.36)为介质的折射指数；Ф(Φ=0.118)为荧光体的量子产率；J为荧光体的发射光谱与受体的吸收光谱间的重叠积分；F(λ)为荧光体在波长λ处的荧光强度；Δλ为荧光光谱和吸收光谱中的波长间隔；ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔消光系数.测定温度为308 K，300～370 nm范围内金属离子与BHb以1∶1的物质的量之比结合的紫外吸收光谱，与BHb荧光发射光谱进行重叠作图(见图4).参照文献[15-16]，分别求得R0，E和r，数值列于表3.

a：牛血红蛋白的荧光发射光谱；

b：金属离子的紫外吸收图谱

图4 Forster非辐射能量转移重叠

血红素中含有的色氨酸(Trp)残基分别为α-14 Trp，β-15 Trp和β-37 Trp，血红蛋白内源荧光主要来自β-37 Trp.当猝灭体与色氨酸残基之间的结合距离r与临界距离R0满足R0

从表3可知，不同温度下Cu2+的结合距离r(1.96 nm和1.94 nm)和Ni2+的结合距离r(2.09 nm和1.85 nm)均小于7 nm，但同时都大于各自的临界距离R0(1.14 nm和1.11 nm).因此，尽管在金属离子与BHb的相互作用中发生了能量转移(r<7 nm)，但引起BHb荧光猝灭的主要原因是静态猝灭(r>R0)[16].这也与荧光猝灭分析的结果一致(见表1).

表3 过渡金属离子与BHb作用的相关性

金属离子T/KJ/(cm3·L·mol-1)E/%R0/nmr/nmCu2+2981.389 4×10-160.0131.141.963081.389 4×10-160.0141.141.94Ni2+2989.390 4×10-170.0221.112.093089.381 1×10-170.0441.111.85

2.2.5 过渡金属离子与BHb之间的相互作用力

小分子和蛋白质主要通过静电作用力、疏水作用力、氢键和范德华力等分子间作用力相结合.根据反应前后的热力学函数变(焓变ΔH和熵变ΔS)，可以判断小分子与蛋白质之间的主要作用力类型.通常，ΔH>0，ΔS>0，为疏水作用力；ΔH<0，ΔS>0，为静电作用力；ΔH<0，ΔS<0，为氢键和范德华力[17].当不发生热力学相变时，在一定温度范围内ΔH基本不变.由以下热力学公式[17]：

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R;

ΔG=-RTlnK;

ΔG=ΔH-TΔS.

结合金属离子与BHb在不同温度下的结合常数KA(见表2)，计算金属离子与BHb相互作用的热力学函数(见表4).由表4可知，过渡金属离子主要以静电作用力与BHb形成不发荧光的基态复合物，导致BHb产生荧光猝灭.

表4 过渡金属离子与BHb之间的相互作用力

金属离子ΔH/(KJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)Cu2+-23.720.13Ni2+-40.0976.78

2.2.6 过渡金属离子对BHb构象的影响

固定波长的同步荧光光谱常用于判断蛋白质构象的改变.固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，分别扫描308 K时BHb中酪氨酸残基和色氨酸残基的同步荧光光谱[11].由图5和图6可知，BHb的荧光主要由色氨酸残基贡献.过渡金属离子基本不改变酪氨酸残基的发射波长和峰形(见图5)，但可以使色氨酸残基的发射波长轻微蓝移(见图6).结果表明，过渡金属离子的加入可增强色氨酸所处环境的疏水性，改变BHb的构象[18].