miR-125b在食管鳞癌中的表达变化及临床意义

方玉松 刘峻岭 张志平 王宗明 尹立国 许鹏

食管癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，病死率高，危害极大。我国是食管癌的高发地区，病理类型以食管鳞癌为主[1]。尽管近年来手术技术和药物治疗手段取得一定的进步，但绝大多数食管癌患者仍难免死于肿瘤局部复发及远处转移，5年总体生存率仍较低[2]。食管癌的形成过程中牵涉到一系列基因和表观遗传学变化，具体作用机制尚不清楚。虽然近年来的研究在分子生物学水平上取得了很大的进展，发现了食管癌发生发展中许多重要的分子事件，但仍不能有效地做到早期检测、早期诊断和特异性治疗。因此，对食管癌发生、发展机制的深入研究是早期诊断和治疗食管癌、提高食管癌患者生存率的关键。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一组由19～25个核苷酸组成的单链非编码小RNA，在机体基因调控网络中发挥着重要的作用[3]。越来越多的研究已证实miRNA能够调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移能力，并且在肿瘤的早期诊断、特异性治疗及预后判断方面具有良好的前景[4]。在食管癌的发生进展过程中目前也发现了许多异常表达的miRNA[5]。miR-125b是miRNA家族的重要成员之一，研究显示miR-125b在胃癌[6]、甲状腺癌[7]、骨肉瘤[8]等许多恶性肿瘤中表达异常,与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移等肿瘤生物学行为密切相关，参与了恶性肿瘤的发生、进展过程。但目前有关miR-125b在食管鳞癌中的研究甚少。本研究检测了miR-125b在食管鳞癌组织和细胞中的表达变化，并进一步分析其与患者临床病理参数及预后的关系，以期为食管癌的早期诊断及预后判断提供新的方向。

材料与方法

一、 研究对象

1. 组织标本和资料：选取2012年1月—2013年1月在山东大学附属济南市中心医院行手术切除的89例食管癌手术标本，均经术后病理学检查确诊为鳞状细胞癌。癌组织标本取自手术切除标本中肉眼观察的肿瘤组织，癌旁组织标本取自距离肿瘤边缘至少5 cm的无瘤组织标本。标本离体后立即液氮暂存，后保存于-80 ℃冰箱待测。89例患者均具有完整的临床病历资料，术前均未进行化疗、放疗等特殊抗肿瘤治疗，于术后开始随访，随访至患者死亡或者术后5年，失访及其他原因的死亡作为截尾数据。所有患者对本研究知情，并签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

2. 细胞和主要试剂:人低分化食管鳞癌细胞系KYSE410、TE-13，人高分化食管鳞癌细胞系EC9706、KYSE510及人正常食管细胞系Het-1均购自中国科学院上海细胞研究所。所有细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(青霉素100 mg/L、链霉素100 mg/L)，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，每隔2～3 d传代1次。TRIzol试剂购自北京天根生化公司；反转录试剂盒及PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒购自大连TaKaRa公司；PCR引物由广州锐博生物科技公司设计合成。

二、 qRT-PCR检测miR-125表达

按照TRIzol试剂说明书操作分别提取食管鳞癌组织、癌旁组织、食管鳞癌细胞系中的总RNA。取100 ng总RNA, 按照反转录试剂盒说明书操作反转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒说明书配置反应体系进行反应。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 变性5 s，60 ℃ 退火34 s，扩增40个循环。miR-125引物：正向：5′-TCCCTGAGACC CTAACT TGTGA-3′，反向：5′-GCGAGCACAGAATTAATA CGAC-3′；内参U6引物：正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA TACT-3′，反向：5′-ACGCTTC ACGAATTT GCGTGTC-3′。以2-△△Ct法表示miR-125b的相对表达量。

三、 统计学分析

结 果

一、 miR-125b的表达

1. 体外培养的食管鳞癌细胞和食管正常细胞：qRT-PCR检测结果显示，食管鳞癌细胞(KYSE410、TE-13、EC9706、KYSE510)中miR-125b的表达显著低于正常食管细胞Het-1A(P<0.05)，且在低分化食管鳞癌细胞(KYSE410、TE-13)中miR-125b的表达显著低于高分化食管鳞癌细胞(EC9706、KYSE510)(P<0.05)(图1A)。

2. 食管鳞癌组织和癌旁组织标本

qRT-PCR检测结果显示，食管鳞癌组织中miR-125b表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05)(图1B)。

二、 miR-125b的表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系

以miR-125b的中值为界值，将患者分为低表达组45例和高表达组44例。统计学分析结果显示：miR-125b低表达与pTNM分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度有关(P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤长度及浸润深度无关(P>0.05)(表1)。

图1 miR-125b的表达。A. miR-125b在体外培养的食管鳞癌细胞和食管正常细胞中的表达。1～5分别表示Het-1、EC9706、KYSE510、KYSE410、TE-13。与Het-1比较，*P<0.05；与EC9706比较，#P<0.05；与KYSE510比较，△P<0.05。B. miR-125b在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达。与癌旁组织比较，*P<0.05

参数低表达组(N=45)高表达组(N= 44)χ2值P值性别0.2790.597 男性32(52.46)29(47.54) 女性 13(46.43)15(53.57)年龄/岁1.4650.226 ≥ 60性40(53.33)35(46.67) <60性5(35.71)9(64.29)分化程度5.2980.021 中高分化22(40.74)32(59.26) 低分化23(65.71)12(34.29)肿瘤长度2.5890.108 ≥ 5 cm24(60.00)16(40.00) < 5 cm21(42.86)28(57.14)pTNM分期5.9510.015 Ⅰ期+ⅡA期17(37.78)28(62.22) ⅡB期+Ⅲ期28(63.64)16(36.36)淋巴结转移8.4610.004 有26(68.42)12(31.58) 无19(37.25)32(62.75)

三、 食管鳞癌组织中miR-125b表达与患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析结果显示：miR-125b低表达组总生存率显著低于miR-125b高表达组(P<0.05)(图3)。Cox回归多因素分析显示：淋巴结转移、pTNM分期、miR-125b低表达是食管癌根治术后患者 预后的独立影响因子(P<0.05)(表2)。

图3 食管鳞癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

因素HR95% CIP值性别1.4490.901～2.4210.119年龄1.1260.757～1.8970.178分化程度0.7240.495～1.2140.226肿瘤长度1.3540.799～2.2500.137pTNM分期2.2681.517～4.0140.031淋巴结转移2.7811.716～4.4360.014miR-125b表达3.1472.358～5.5780.009

讨 论

食管癌是目前世界范围内发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤之一，虽然食管癌的手术治疗及放化疗方面在一定程度上取得了进步，但由于食管癌的早期诊断困难，其5年生存率仍没有取得明显的提高，因此寻找能够用于食管癌筛选、早期诊断及预后判断的有效的分子标志物意义重大，也是目前研究的热点问题。目前，食管癌发生发展的具体机制尚不完全明确，研究发现多种miRNA在恶性肿瘤中异常表达，调控恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移，参与肿瘤的发生发展，在肿瘤的早期诊断、预后判断方面起着重要的作用，已成为目前肿瘤研究的热点问题[9]。研究已经证实，许多miRNA表达失衡在食管癌的发生发展中发挥着重要作用，与食管癌的分期及预后密切相关[10]。Chang等[11]在研究中发现miR-655在食管癌中表达降低，并且与食管癌的不良预后密切相关，上调miR-655的表达能够抑制食管癌细胞的增殖和侵袭。陈述等[12]通过基因芯片技术对中国新疆地区食管癌组织中miRNA水平进行筛查，最终通过qRT-PCR证实miR-181c-3p和miR-5692b在食管癌组织中表达升高，并且认为miR-181c-3p和miR-5692b可作为食管癌进展和预后的潜在预测指标。

miR-125b是近期新发现的miRNA家族成员之一，定位于人类染色体19q13，研究发现其在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、侵袭及转移等众多肿瘤细胞生物学活性方面发挥着重要作用[13]。既往研究显示miR-125b在胃癌[6]、肾细胞癌[14]等癌组织中表达增高，作为癌基因发挥作用，而在甲状腺癌[7]、骨肉瘤[8]、乳腺癌[15]等癌组织中表达降低，作为抑癌基因发挥作用。因此认为，miR-125b可能在不同的肿瘤、不同的上下游通路中发挥着不同的作用。本研究中我们通过qRT-PCR检测了食管鳞癌组织、癌旁组织和食管鳞癌细胞系、人正常食管细胞系中miR-125b的表达水平，发现miR-125b在食管鳞癌组织中的表达较癌旁组织明显降低，并且miR-125b在食管鳞癌细胞系中的表达较人正常食管细胞系明显降低，提示miR-125b在食管鳞癌中可能起着抑癌基因的作用。进一步统计分析发现，miR-125b在低分化食管鳞癌细胞中的表达显著低于高分化食管鳞细胞，并且食管鳞癌组织中miR-125b低表达与pTNM分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度相关，进一步提示miR-125b的异常低表达与食管鳞癌的发生发展及转移密切相关。

目前有关miR-125b表达异常与恶性肿瘤患者预后关系的研究较少。Wu等[6]在研究中发现胃癌组织中miR-125b的异常高表达的胃癌患者5年生存率较低。Li等[16]报道脑胶质瘤组织中miR-125b高表达的患者预后较差。Luo等[17]发现骨肉瘤患者血清中miR-125b低表达患者无病生存期和总生存期较短。至今尚未见miR-125b与食管鳞癌患者预后关系的研究报道。本研究发现，miR-125b低表达组患者的预后较差，并且miR-125b低表达是影响食管癌根治术后患者预后的独立影响因子。

综述所述，miR-125b在食管鳞癌组织和细胞中表达异常降低，食管鳞癌中miR-125b的异常低表达与食管鳞癌的发生发展及预后具有相关性，为寻找食管鳞癌早期诊断及预后预测分子生物学标志物提供了新的参考。