丹皮酚对老年人牙周状况的影响研究

王红梅 蔡兴伟 徐 迈 何 鑫 郝作琦

口腔是人体消化道的入口，既有消化功能，又存在大量微生物，因此口腔健康对人体健康起着至关重要的作用，而口腔维护是清洁口腔、预防口腔及全身疾病的重要手段[1]。牙周病是局部慢性感染性口腔疾病，以厌氧菌感染为主，牙周袋内的细菌、微生物及其产物扩散至附近或远隔器官，从而导致慢性炎症状态，造成牙周组织破坏[2,3]，老年人由于身体机能退化，这一过程更为迅速。在牙周炎发生发展过程中，MMPs中的MMP-3可以剪切、活化其它类型MMPs，并引起牙槽骨吸收和改建[4,5]。有研究显示丹皮酚(Paeonol，Pae)具有镇静、解热、抗炎、免疫调节以及抗氧化等药理特性[6,7]，推测丹皮酚对牙周组织同样具有抗炎和调节免疫的功效。因此，根据老年人的生理、心理和社会特点，本研究通过观察使用丹皮酚水提取物对老年人进行口腔维护前后GCF总量、GCF中MMP-3水平的变化以及5种牙周致病菌的检出率，探讨丹皮酚对老年人牙周组织炎症的影响，为选择简便合理的临床口腔维护方式提供参考。

1.材料与方法

1.1 病例纳入及分组 选择2015年6月～2017年6月在火箭军特色医疗中心口腔科进行口腔常规体检的老年患者(≥60岁)120例，男性68例，女性52例，年龄(60.2±4.5)岁，以随机数法平均分为A、B、C三组：A组患者使用丹皮酚水提取物(500mmol/L含漱，不低于1min)漱口；B组患者使用医用棉签蘸取双氧水(3%)擦拭牙龈组织，每象限擦拭时间1min；C组患者使用生理盐水含漱1min。各组患者每天按分组状况维护6次并进行常规口腔维护(早中晚三次刷牙，Bass刷牙法)。纳入条件：无未充填的龋坏，无中、重度慢性成人牙周炎且无全身系统性疾病，口内余留牙不少于20颗，口内检测AL＜3mm[8]；研究开始一周前进行牙周洁治；3个月内未使用抗生素以及免疫抑制剂。三组患者一般资料(年龄、性别、职业、婚姻、学历、基础疾病史等)比较无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性。所有患者均知情同意。

1.2 材料 标准菌株(第四军医大学口腔内科学实验室，中国)；丹皮酚(中国药品生物制品检定所，中国)，酶联检测仪(南京华东电子，中国)；ELISA试剂盒(广州欣盛生物工程有限公司，中国)；Whatman专用滤纸(Whatman公司，英国)。

1.3 口腔检查 受试者的口腔检测由同一位高级职称医师完成。使用Williams牙周探针检测全口余留牙齿6个位点(颊面近中，中部，远中；舌面近中，中部，远中)。记录探诊深度(probing depth，PD)以及附着丧失程度(attachment loss，AL)，取平均值并且记录菌斑指数(plaque index，PLI)以及缺牙数及牙齿松动度。

1.4 采集样本 将Whatman滤纸裁成8mm×3mm大小，消毒、烘干并称重。吹干检测区域、隔湿，将滤纸插入待测患牙颊侧中部龈沟内，1min后取出并再次称重，复检三次取平均值，前后质量差为GCF量。滤纸使用2%PBS液离心(10000r/min，10min)后提取上清液，于低温冰箱-70℃保存待检。患者每周进行电话随访，并于1个月和3个月后复查，采集龈沟液样本。

1.5 测定MMP-3含量 解冻样本，稀释后加入生物素标记的抗体，振荡混匀37℃温育1h，洗涤后吸干并重复3次；加入亲和链酶素-HRP混匀，37℃温育30分钟后吸干，重复3次加入底物振荡混匀，37℃温育10min，加入终止液并立即测定MMP-3含量(MMP含量=MMP总量/GCF量；MMP总量=MMP检测量×洗脱体积)。

1.6 牙周致病菌的检测 维护前后，分别将各组患者检测区域吹干并用无菌棉球严格隔湿后，去除龈上菌斑和牙结石，采用4-site法(患者口内按象限分为四个区，每个区牙周探诊最深点作为取样点)使用无菌刮匙刮取龈袋底的龈下菌斑，在待测牙颊侧中部取样点插入标准灭菌纸尖至牙周袋底，静置10s后取出纸尖装入含有厌氧转送液的离心管，加入2%PBS液高速离心(12000r/min，10min)后提取沉淀DNA。自行设计、合成引物(表1)，对龈下菌斑DNA进行扩增，以5种标准菌株：伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,A.a)(ATCC 29523)、牙龈卟啉单孢菌(Porphyromonas gingivdis,P.g)(ATCC33277)、中间普氏菌(Prevotella intermedia,P.i)(ATCC 25611)、福赛氏类杆菌(Tannerella forsythia,T.f)(ATCC 43037)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola,T.d)(ATCC 43037)为阳性对照，以变异链球菌(ATCC 27607)为阴性对照。

表1 5种牙周致病菌特异性引物序列

1.7 统计学分析 使用SPSS22.0软件对数据进行统计学处理，本实验为测量时间间隔不等重复资料，采用不等距重复测量的方差设计，P＜0.05为具有统计学意义。

2.结果

最终完成维护的患者共120人，使用重复测量资料的方差分析，组间和组内比较分别使用LSD检验和Bonferroni检验。

2.1 牙周指标比较 组内比较时，A、B两组维护后PD、PLI指数在1个月、3个月与维护前相比均有显著性差异(P＜0.05)；AL指数仅在3个月时与维护前相比均有显著性差异(P＜0.05)；C组维护前后相比无显著性差异(P＞0.05)。组间比较时，A、B两组PD、PLI指数与C组在维护后的不同时间点均有显著性差异(P＜0.05)；而仅在3个月时A、B两组AL指数与C组比较有显著性差异(P＜ 0.05)(表 2～表 4)。

2.2 GCF量、MMP-3含量比较、组内比较时，A、B两组维护后GCF量、MMP-3水平在1、3个月与维护前相比均有显著性差异(P＜0.05)，C组维护前后相比无显著性差异(P＞0.05)。组间比较时，A、B两组与C组在维护后的不同时间点均有显著性差异(P＜0.05)，而仅在3个月时A、B两组GCF量、MMP-3水平比较有显著性差异(P＜ 0.05)(表 5，表 6)。

2.3 5种牙周致病菌的检出情况比较 A、B组致病菌的检出率与维护前比较具有显著性差异(P＜0.05)，C组牙龈卟啉单孢菌、中间普氏菌和福赛氏类杆菌与维护前比较无统计学意义(P＞0.05)，齿垢密螺旋体和伴放线放线杆菌的检出率与维护前比较具有显著性差异(P＜0.05)；B组和C组牙周致病菌检出率高于A组(P＜0.05)；C组牙周致病菌检出率高于B组(P＜0.05)(表7)。

表2 牙周指数PD维护前、后的分组比较(x±s)

表3 牙周指数AL维维护前、后的分组比较(x±s)

表4 牙周指数PLI维护前、后的分组比较(x±s)

表5 GCF量维护前、后的分组比较(x±s)

表6 MMP-3含量维护前、后的分组比较(x±s)

表7 5种牙周致病菌的检出情况比较(N/%)

3.讨论

大部分老年患者缺乏口腔维护健康知识，进行口腔维护时，应该从患者生理、心理、社会的特点出发，做好不同年龄、职业以及经济收入的人群的口腔维护教育工作，耐心听取患者的意见，缓解患者的紧张情绪，使其接受维护和治疗[9]。在维护前，要了解老年患者口腔大体情况，并且在与患者积极沟通的情况下，征得本人同意进行维护和治疗，维护过程中需要加强与患者的交流与沟通，患者的配合对于治疗和维护有着非常重要的意义。

丹皮酚(C9H10O3)是芍药科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的根皮中主要的药物活性成分，具有抗动脉粥样硬化、抗心律失常、促进微循环、保护缺血组织、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用[10]。目前尚无Pae对牙周组织炎症的报道。GCF是牙龈组织分泌的一种体液，主要来源于龈沟上皮和结缔组织的破坏产物；牙周组织产生的间质液；血浆以及龈下微生物的产物，可以用来反映牙周组织的健康情况。MMP-3是一种含有二价锌离子酶活性中心的蛋白水解酶的基质溶解素，MMP-3可以剪切、活化并诱导其它类型MMPs表达[11]，以引起牙槽骨的吸收和改建。MMP-3还可以降解细胞外基质，在组织破坏与重建中起重要作用[12]。MMP-3主要由破骨细胞、破牙骨质细胞以及牙周膜成纤维细胞分泌，可以反映牙周炎症的程度[13]。因此，MMP-3水平可作为反映牙周组织的破坏和炎症水平，是评价牙周组织临床及维护疗效的客观指标之一。

本实验结果显示A、B两组维护后牙周指数出现不同程度的下降，GCF量、MMP-3水平有显著性下降(P＜0.05)，C组无明显差异(P＞0.05)。维护后的同一时间点A、B两组与C组有显著性差异(P＜0.05)，而在3个月时A、B两组GCF量、MMP-3水平比较有显著性差异(P＜0.05)。说明丹皮酚漱口和双氧水擦拭的维护方式可以减少牙周组织进一步损伤，使炎性细胞因子分泌下降，并改变中性粒细胞的趋化功能，使炎症介质分泌减少，牙周组织炎症得以恢复。相同的环境下丹皮酚漱口比双氧水擦拭的维护方式要更优越，这可能是因为丹皮酚更强力的抗炎和调节免疫效果，具体机制需要通过进一步实验来验证。

牙周炎发生发展过程中细菌感染是始动因素。本研究选取5种公认的牙周可疑致病菌，其中P.g是重要的牙周致病菌之一，牙周炎症越重，龈下菌斑中P.g的检出率越高，P.g、T.f和T.d三者又称“红色复合体”，具有显著的毒力和致病性，能干扰宿主的防御机制以破坏牙周组织。本研究采用PCR法进行厌氧菌检测。结果表明丹皮酚与双氧水都有一定的抑菌作用(P＜0.05)，而生理盐水不具备这样的作用(P＞0.05)，丹皮酚与双氧水比较时显示丹皮酚可以显著降低老年人牙周可疑致病菌的检出率(P＜0.05)。

本研究通过观察三种不同的口腔维护方式对老年人GCF、MMP-3水平变化的影响以及牙周致病菌的检出率，说明丹皮酚漱口和双氧水擦拭的维护方式比生理盐水漱口的维护方式预后效果更好，而丹皮酚漱口的维护方式效果更为优越，为临床牙周炎的维护选择提供理论实验依据。同时3种维护方式对于牙周指数指标、GCF以及MMP-3水平的长期影响以及对于口腔正常菌群的影响还需要进一步跟踪研究。