H PL C法测定丹参地上部分中丹酚酸B和迷迭香酸的含量

孙立秋，王金兰，赵 明，李 军，王 丹，时志春，张树军

（齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006）

丹参（Salvia miltiorrhiza Bge） 为唇形科多年生草本植物，主产于陕西、山东、山西、河南、河北等地[1]，以根入药，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效[2]，是心脑血管病及多种炎症的常用药材。由于丹参地上部分约占全草的2/3，而且每年均可采收，有更丰富的资源，但丹参地上部分大多被遗弃，未得到有效利用，造成药用资源的浪费和生态环境的污染[3]。研究表明[4]，丹参地上部分含有丰富的丹酚酸类[5]、黄酮类[6]、三萜类等化学成分，具有较强的抗氧化[7]、降血糖等活性，并能有效改善脑梗塞、脑缺血等症状[8]，其中丹酚酸B和迷迭香酸等水溶性成分[9]在临床上广泛用于治疗心血管系统疾病[10]。为了开发丹参地上部分药用资源利用，采用H PLC法对丹参地上部分中丹酚酸B和迷迭香酸的含量进行了分析评价。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司产品；KQ3200D E型数控超声波清洗器，昆山超声仪器限公司产品；Sarturius BT 124S/BT 25S型电子天平。

丹参地上部分由密山市康华中药材种植专业合作社提供的2017年8月8日采集品；甲醇及其他试剂均为色谱分析纯；水为娃哈哈纯净水；对照品丹酚酸B（98.51%，M UTS-18040503），成都曼思特生物科技有限公司提供；迷迭香酸（＞97%，J1613019），阿拉丁试剂有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse X DB-C18型（4.6 mm×250 mm，5 m）；流动相:甲醇（A） -0.8%冰乙酸水溶液 （B） 梯度洗脱 （0～3 min，30%A→31%A；3～53 min，31%A→35%A，53～65 min，35%A→40%A，V/V）；流速1 mL/min，进样量5μL，柱温35℃，检测波长250 nm。

1.2.2 丹酚酸B和迷迭香酸对照品溶液配制

精密称取丹酚酸B和迷迭香酸对照品7.0 mg和6.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释至刻度，制得质量浓度分别为0.70 mg/mL和0.60 mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液配制

取干燥至恒质量的丹参地上部分，精密称取粉碎后的丹参地上部分粉末8.42 g，置于带有回流冷凝器的250 mL圆底烧瓶中，每次加入80.0 mL甲醇，加热回流1.5 h，回流提取3次，过滤后合并滤液浓缩至恒质量，得丹参地上部分甲醇提取物。精密称取上述醇提物，配制成质量浓度为5 mg/mL的供试品溶液，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，备用。

1.2.4 色谱分析

精密吸取供试品溶液、丹酚酸B和迷迭香酸对照品溶液各5μL，在“1.2.1”项的色谱条件下进行分析，得供试品溶液色谱图和丹酚酸B（D B）和迷迭香酸（M D）的混合对照品溶液色谱图。

供试品溶液色谱图见图1，迷迭香酸（M D） 的混合对照品溶液色谱图见图2。

图1 供试品溶液色谱图

图2 迷迭香酸（M D） 的混合对照品溶液色谱图

2 结果与分析

2.1 线性关系及检测限和定量限

精密移取丹酚酸B（0.70 mg/mL） 和迷迭香酸（0.60 mg/mL） 贮备液适量，分别用甲醇稀释至质量浓度为 14.0，35.0，70.0，140.0，700.0 μg/mL 和12.0，30.0，60.0，300.0，600.0 μg/mL 的对照品溶液，精密吸取上述溶液各5μL，进行高效液相色谱分析，连续进样3次，记录峰面积。以质量浓度为横坐标，所对应的峰面积为纵坐标，分别对丹酚酸B和迷迭香酸的质量浓度进行线性回归分析，得回归方程分别为Y=1 177.1X+26.851，R2=1.0；Y=1 468.9X+112.21，R2=0.999 3。表明丹酚酸B的质量浓度14.0～700μg/mL，迷迭香酸的质量浓度12～600μg/mL时有良好的线性关系。

经H PLC测定，以信噪比（S/N） 为3和10所对应样品中该物质的质量浓度分别计算检限测（L OD）和定量限（L O Q），丹酚酸B和迷迭香酸的检测限检出限L OD（S/N=3） 分别为0.2，0.3μg/mL；定量限L O Q（S/N=10） 分别为1.0，1.0μg/mL。

2.2 精密度试验

精密吸取对照品溶液丹酚酸B和迷迭香酸5μL，在“1.2.1”项的色谱条件下进行分析，连续进样3次，记录色谱峰面积。分析计算得丹酚酸B和迷迭香酸各峰面积的RS D分别为3.18%和1.99%，精密度良好。

2.3 稳定性试验

分别精密吸取丹酚酸B和迷迭香酸对照品溶液5 μL，依次在 0，4，8，12，16，18，24 h 进样分析，记录各色谱峰面积，计算得其RS D分别为3.42%和3.85%，表明2种对照品在24 h内都稳定。

2.4 样品含量测定

精密吸取供试品溶液5μL，在“1.2.1”项的色谱条件下进行分析，记录色谱峰面积，用标准曲线法计算丹参地上部分丹酚酸B和迷迭香酸含量分别为5.24%和0.59%。

2.5 重复性试验

取同一批样品，精密吸取供试品溶液5μL，连续进样6次，记录各色谱峰面积，测定丹酚酸B和迷迭香酸的含量分别为5.23%和0.59%，其RS D分别为1.32%和1.14%。表明该方法重复性好。

2.6 加样回收率试验

精密称取同一批已知对照样品含量80%，100%，120%的丹参地上部分，共9份，每3份1组，分别加入对照品丹酚酸B和迷迭香酸（质量浓度分别为0.12，0.03 mg/mL） 1 mL进样分析，记录色谱峰面积。结果表明，丹酚酸B和迷迭香酸的平均回收率分别为99.16%和101.11%，其RS D分别为0.735%和2.11%。

3 结论

丹参作为常用传统中药，市场上已开发出多种制剂，但均以根入药，资源更为丰富的地上部分并未得到有效利用，随着临床应用范围的扩大，亟需寻找新药源。据文献[11-12]可知，丹参根部中丹酚酸B和迷迭香酸的含量分别在1.81%～11.55%和0.11%～0.74%，试验以丹参地上部分为研究对象，经H PLC法对由密山市康华中药材种植专业合作社提供的丹参地上部分中丹酚酸B和迷迭香酸的含量进行分析，得丹酚酸B和迷迭香酸的含量分别为5.24%和0.59%，与根部含量相当，表明丹参地上部分作为获取丹酚酸类化学成分的新资源具有很好的应用前景。