黄秦艽的化学成分分析

张琼光, 龚韦凡，梅枝意，黄先菊，杨光忠，李竣*

(1 国家药品监督管理局食品药品审核查验中心, 北京100061; 2 中南民族大学 药学院, 武汉430074)

龙胆科黄秦艽属植物黄秦艽Veratrillabaillonii.，又名滇黄芩、丽江金不换、大苦参、黄龙胆，主要分布于我国四川、云南、西藏等地.黄秦艽是云南地方常用中草药，被收载于1974 年和2005年版《云南省中药材标准》，其以根入药，具有清热解毒、消炎杀虫等功效，在临床上主要用于治疗肺热咳嗽、阿米巴痢疾、黄疸型肝炎和蛔虫病[1].有关黄秦艽化学成分的研究较少，目前证明其主要化学成分是黄酮类化合物[2,3].本研究前期从黄秦艽药材的醇提物中分离并鉴定出26个化合物，其中含有6种环烯醚萜类化合物[4].本文拟通过指纹图谱与单体化合物的比对，及总黄酮和总环烯醚萜含量测定方法的建立，为黄秦艽的质量控制、产品的生产制备工艺优化及进一步开发提供基础理论依据[5-7].

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(DIONEX Ultimate 2000，DIONEX，美国)；色谱柱(Phenomenex Synergi 4μ Polar-RP 80A 00G-4336-E0，Phenomenex，美国)，UV-1800紫外-可见分光光度计(UV-1800，上海美谱达)；超纯水仪(Milli-Q plus system，美国Millipore)；旋转蒸发仪(RE 52-98型，上海亚荣)；旋片真空泵(2XZ-1型，浙江黄岩天龙真空泵厂)；超声仪(KQ-500E型，昆山市超声仪器)；电子天平(AUW-120D型，日本岛津)；电热恒温水槽(DK-8B型，上海精宏).

1.2 试药

1-羟基-2,3,4-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基口山酮、Tetraswerosides A、Secamonoides B、1-羟基-2,7-二甲氧基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基口山酮、2,3,4,7-四甲氧基1-O-樱草糖氧基口山酮、当药苷、龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、1-羟基-3,4-二甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖基口山酮、邻苯二甲酸二异丁酯、1,7-二羟基-2,3,4-三甲氧基口山酮、1-羟基-2,3,5-三甲氧基口山酮、1-羟基-2,3,4,7-三甲氧基口山酮、Tripteroside、金不换苷B、2,3,5-三甲氧基-1-O-樱草糖氧基口山酮、2,3,4,5-四甲氧基口山酮-1-O-龙胆二糖苷、富马酸二丁酯、1,7-二羟基-3,4-二甲氧基口山酮、1,3-二羟基-4,7-二甲氧基口山酮、1,7-二羟基-3-甲氧基口山酮、1-羟基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮、1-羟基-2,3,7-三甲氧基口山酮、2′-间羟基苯甲酰獐牙菜苷、Amaronitidin、苦杏仁苷均为实验室自制；乙腈(色谱纯，美国Tedia)；其他均为分析纯(国药集团化学试剂).

2 方法与结果

2.1 黄秦艽化学成分分析

2.1.1 色谱条件

Phenomenex Synergi色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈和0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长为254 nm，进样量为10 μL[8,9].(程序见表1)

表1 黄秦艽HPLC指纹图谱梯度洗脱时间顺序Tab.1 Gradient elution time sequence of HPLC fingerprints of V.baillonii.

2.1.2 样品溶液的制备

黄秦艽样品粉碎过40目筛，称取0.5 g粉末，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇精密称定并定容，超声20 min提取，放置室温，甲醇补足质量后摇匀，以0.45 μm微孔滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液为供试品溶液，以2.1.1色谱条件分析，得到黄秦艽的指纹图谱(见图1)，标定色谱峰.单次进样所分离的化合物，对上述色谱峰进行定性分析，结果见表2.

图1 黄秦艽醇提物指纹图谱Fig.1 Figureprint HPLC of ethanol extract from V. baillonii.

表2 黄秦艽HPLC成分分析结果Tab.2 HPLC identification results of V. baillonii.

*峰号26苦杏仁苷未检出

2.2 黄秦艽醇提物总黄酮含量测定

2.2.1 标准品溶液的制备

精密称取1-羟基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮对照品10.10 mg，甲醇溶解，制成0.101 mg/mL的对照品溶液.

2.2.2 供试品溶液的制备

将黄秦艽药材粉碎，过40目筛，称取1.0 g粉末，置于圆底烧瓶中，加入20 mL甲醇，加热回流提取3次，每次 2 h，放冷，提取液减压浓缩，转移至25 mL 量瓶中，甲醇定容，振摇均匀，得供试品溶液.

2.2.3 显色与测定方法

取对照品溶液和供试品溶液各1.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，依次加入5%NaNO2溶液(即100 mL溶液中含有5 gNaNO2，下同)和10% Al(NO3)31.0 mL，每次混匀静置6 min，加入4% NaOH溶液10 mL，甲醇定容混合均匀，保温静置15 min，阴性实验按上述方法进行，在353 nm波长处测定吸光度.

2.2.4 专属性实验

取对照品、阴性对照及供试品溶液各1.0 mL，按“2.2.3”项下显色与测定，在200～600 nm范围进行全波长扫描(间隔1 nm).结果显示对照品及供试品溶液均在353 nm波长处有最大吸收，阴性对照无吸收.

2.2.5 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，按“2.2.3”项下方法操作，在λmax=353 nm 波长处分别测定吸光度(A).以吸光度值为纵坐标Y，浓度(μg /mL) 为横坐标X，绘制标准曲线，得到线性回归方程为:Y=0.03X+0.3867(r=0.9995).结果表明，1-羟基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮对照品溶液在 2.0～10.1 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系.

2.2.6 方法学考察

精密度试验：取系列浓度对照品溶液中的任意一份，按“2.2.3”项下的操作方法处理后，连续用紫外分光光度计于353 nm处扫描5次，记录吸光度，计算RSD值为0.43%，表明仪器的精密度良好.

稳定性试验：供试品溶液按“2.2.3”项下的操作方法处理后，分别在0，15，30，60，120，240，360 min测定吸光度，计算RSD值为0.32%，表明样品溶液在360 min内稳定性良好.

重复性试验：制备3份供试品溶液，按“2.2.3”项下的操作方法处理后，分别测定吸光度，计算RSD值为1.5 %，表明该含量测定方法重复性良好.

2.2.7 加样回收率试验

精密称量6份已知含量的黄秦艽药材粉末，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，分别精密加入不同量的1-羟基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮对照品溶液，按照“2.2.3”项的反应条件测定，结果黄秦艽的平均加样回收率为97.7%，RSD为0.4%(见表3).表明该含量测定方法的准确度良好可靠，加样回收率实验数据.

2.2.8 供试品总黄酮含量测定

将供试品溶液按“2.2.3”项下的操作方法处理后，测定吸光度，重复6次.结果该黄秦艽药材醇提物中总黄酮的平均含量为31.25%，RSD=0.13%.

表3 黄秦艽总黄酮的加样回收率结果(n=6)Tab.3 Recovery results of total flavonoids from V. baillonii

2.3 总环烯醚萜含量测定

2.3.1 标准品溶液的制备

精密称取龙胆苦苷对照品7.70 mg，甲醇溶解，制成0.077 mg /mL 的对照品溶液.

2.3.2 供试品溶液的制备

将黄秦艽药材粉碎，过40目筛，称取1.0 g样品粉末，置于圆底烧瓶中，按“2.2.2”项下方法制备，即得供试品溶液.

2.3.3 显色与测定方法

精密吸取对照品溶液1.0 mL，干燥，加入5%香草醛高氯酸试液0.5 mL，混匀，置于70 ℃恒温水浴锅上水浴加热90 min.水浴加热完成后，用冰水冷却试管2 min，加入体积比为77%浓硫酸溶液5 mL，振摇均匀，直至溶液颜色一致.阴性实验按上述方法进行，在540 nm波长处测定吸光度.

2.3.4 专属性实验

取对照品、阴性对照及供试品溶液各1.0 mL，按“2.3.3”项下显色与测定，以紫外分光光度计在200～600 nm进行全波长扫描(间隔1 nm).结果显示，对照品及供试品溶液均在540 nm波长处有最大吸收，阴性对照无吸收，故以540 nm为样品的测定波长.

2.3.5 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，按“2.3.3”项下的方法操作，在λmax=540 nm 波长处分别测定吸光度(A).得线性回归方程为:Y=0.0059X+0.3012(r=0.9997).表明龙胆苦苷对照品溶液在15.4～77.0 μg /mL内线性关系良好.

2.3.6 方法学考察

精密度试验：取系列浓度对照品溶液中的任意一份，按“2.3.3”项下的操作方法处理后，连续用紫外分光光度计于540 nm处扫描5次，记录吸光度，计算RSD值为0.68%，表明仪器的精密度良好.

稳定性试验：供试品溶液按“2.3.3”项下的操作方法处理后，分别在0, 0.5, 1.0, 1.5, 2 h测定吸光度，计算RSD值为0.57%，表明样品溶液在2 h内稳定性良好.

重复性试验：制备份供试品溶液，按“2.3.3”项下的操作方法处理后，分别测定吸光度，计算RSD值别为0.55%，表明该含量测定方法重复性良好.

2.3.7 加样回收率试验

精密称量9份已知含量的黄秦艽药材粉末，按“2.2.2”项下方法制备9份供试品溶液，分别精密加入不同量的龙胆苦苷对照品溶液，制备3个不同浓度的样品，每个浓度平行测定3份，按照“2.3.3”项的反应条件测定，结果黄秦艽的平均加样回收率为98.4%，RSD为1.0%.表明该含量测定方法的准确度良好可靠，加样回收率实验数据见表4.

表4 黄秦艽总环烯醚萜的加样回收率实验结果(n = 9)Tab.4 Recovery results of total iridoids from V.baillonii

2.3.8 供试品总环烯醚萜含量测定

将供试品溶液按“2.3.3”项下的操作方法处理后，测定吸光度，重复6次.结果该黄秦艽药材醇提物中总环烯醚萜的平均含量为20.91%，RSD=0.38%.

3 结语

本文以黄秦艽药材为研究对象，以前期从黄秦艽中分离鉴定的单体成分作为样品，建立了黄秦艽醇提物HPLC指纹图谱分析方法和完整的指纹图谱，通过黄秦艽醇提物指纹图谱可知：黄秦艽主要化学成分为口山酮和环烯醚萜类，其中黄秦艽中相对含量较高的组分为龙胆苦苷(峰6)、Tripteroside(峰7)、1,3-二羟基-4,7-二甲氧基口山酮(峰20)、1-羟基-2,3,5 -三甲氧基口山酮(峰22)、1-羟基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮(峰23)、1-羟基-2,3,7 -三甲氧基口山酮(峰24)、1-羟基-2,3,4,7-四甲氧基口山酮(峰25).

药材总黄酮含量测定的方法常选用芦丁作为对照品，经显色后UV最大吸收波长在510 nm处，但预实验中样品在510 nm处未出现吸收.黄秦艽根部的黄酮属于口山酮类化合物，较少出现邻二酚羟基或芦丁的5-羟基与羰基形成络合物显色，因此在测定黄秦艽总黄酮时不宜使用芦丁作为对照品，故选取从黄秦艽中得到的1-羟基-2,3,4,5-四甲氧基口山酮作为标准品测定总黄酮含量.

黄秦艽作为传统的民族药在民间广泛的使用[10]，但其药材中总环烯醚萜和总黄酮类药效成分含量尚未见文献报道.为了解黄秦艽药材品质的优劣，规范其临床使用标准，本文通过紫外分光光度法测定黄秦艽醇提物的总黄酮和总环烯醚萜的含量，确定了黄秦艽中24个主要成分的HPLC指纹图谱，建立了一种新的控制黄秦艽药材质量方法，为黄秦艽药材的质控和开发提供了理论依据.