具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2菌株的分离鉴定及其attB位点的分析

李晓华，黄粤，马婷婷，皮婷，姚家成，夏珍珍，冯喆，温馨

(中南民族大学 生命科学学院/微生物资源与利用湖北省工程技术研究中心，武汉 430074)

稻瘟病菌是一种能让多种草本植物发生病变的病原真菌，水稻等多种农作物会受其感染[1].稻瘟病每年都给我国的水稻产量带来相当大的损失[2].稻瘟病菌几乎不分季节地侵害水稻，危害时间长，侵染部位多，感染病状也极为多样.稻瘟病菌菌丝和孢子主要在染病的植物体上越冬，次年又继续感染第二年的作物，稻瘟病菌的孢子还可以借助空气传播，是一种顽固的农作物病害真菌.在传统的农业病害防治中，化学农药防治稻瘟病一直是主要手段，但长时间大剂量地使用化学农药带来生态环境破坏等负面影响[3,4].生物防治逐渐成为农作物病害防治的一种重要手段，农用抗生素具有对人、畜、禽和非目标生物安全低毒，对环境破坏小，易分解等优点，在生物防治农作物病害中扮演着重要的角色[5].

本实验室从湖北省神农架地区土壤中分离得到一株具有抗稻瘟病菌活性的微生物，以稻瘟病菌NO-1为指示菌，用琼脂扩散法和杯碟法测定该菌株次级代谢产物对稻瘟病菌NO-1的抑菌活性，研究其发酵特性，分析其发酵液特性，利用PCR技术克隆attB序列，对attB序列进行分析，为抗稻瘟病菌微生物的利用奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料

土壤样品从湖北省神农架地区烟草种植地采样，装入无菌袋中，对微生物进行分离．指示菌稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)NO-1菌株由本实验室保藏.

1.2 菌株分离

称取10 g 土样置于含90 mL无菌水的三角瓶中，于30 ℃，180 r/min 振荡培养2 h，10倍稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的土壤悬液，分别涂布在含有不同浓度重铬酸钾的高氏I号培养基上，在30 ℃的生化培养箱中倒置培养4 d，经过多次挑单菌纯化后，收集孢子至20%甘油中，-20 ℃保存．

1.3 菌种鉴定

对筛选到的菌种进行形态结构观察和生理生化鉴定[9]，提取菌株总DNA[9]，采用通用引物F1( 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和F2 ( 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′) 进行扩增. PCR反应体系: 10 ×PCR Buffer 1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，dNTP 1.0 μL，一对引物各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，用超纯水定容至15.0 μL. 扩增条件: 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循环30次，最后72 ℃延伸10 min. 测序结果通过Blast在GenBank 基因库中与相关菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比对分析. 利用MEGA7.0对ⅠT2菌株的16S rDNA基因序列比对构建系统发育树(采取N-J法，bootstrap value为1000) ．

1.4 ⅠT2菌株的抑菌活性测定

利用杯碟法[11]测定放线菌ⅠT2菌株发酵液的抑菌活性，琼脂扩散法[9]测定ⅠT2菌株菌块的抑菌活性，十字测量法测量抑菌圈直径.

1.5 ⅠT2菌株attB位点克隆与分析

以ⅠT2菌株的总DNA为模板，以噬菌体ΦC31的attB位点保守序列设计的一对引物[12]attB1:5′-CGGATCCGACCC(G/C)TTCA-CATGATGGAC-3′，attB2:5′-TGGAATTCAGGTT(G/C)ACCCA(C/G)AGCTG(G/C)AG-3′扩增ⅠT2菌株的attB位点序列，PCR扩增条件: 95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min，循环35次，最后72 ℃延伸7 min. 测序结果通过Blast在GenBank基因库中比对分析．

2 结果和分析

2.1 ⅠT2菌株的分离鉴定

以植物病原真菌稻瘟病菌NO-1菌株为指示菌，取培养120 h的ⅠT2菌株菌块，检测其抗稻瘟病活性，结果如图1所示.

A～D)ⅠT2菌株菌块；E)琼脂块图1 ⅠT2菌株对稻瘟病NO-1菌株的抑菌活性Fig.1 Antifungal activity of ⅠT2 strain against Pyricularia oryzae NO-1

ⅠT2菌株菌块对稻瘟病菌NO-1菌株的抑菌圈平均直径为29.7 mm，表明ⅠT2菌株对稻瘟病菌NO-1菌株具有较强的抑菌活性.

将ⅠT2菌株接种于高氏I号培养基上，30 ℃培养120 h后，基内菌丝和气生菌丝生长良好，呈灰白色.ⅠT2菌株革兰氏染色呈阳性，淀粉水解为阳性，甲基红试验为阴性；不产生H2S；能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖和甘露醇.

以ⅠT2菌株总DNA为模板扩增ⅠT2菌株16S rDNA序列并测序，ⅠT2菌株16S rDNA序列长度为1348 bp. 采用MEGA7.0构建系统进化树，选择N-J法，设置Bootstrap值为1000，结果如图2所示，ⅠT2菌株16S rDNA序列与来源于Streptomycesclaviferstrain KAR51的16S rDNA序列具有99%同源性，初步鉴定ⅠT2菌株属于链霉菌属.

虽然大事记的收录标准和编写规定在志书编纂规则中有明确规定，但编者面对志书中的各种实际问题，具体的收录与删增是以编者对事情的认识和编纂水平决定的，所以，编者一方面要熟悉各种标准规范，一方面要通读全志，内心要有正确的衡量标准，小心斟酌、细心思考，对资料要注意保存备查，对内容要进行前后反复核对修定，以使全志的时间及相关资料前后统一。

图2 基于16S rDNA序列的系统进化树Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

2.2 不同发酵条件对链霉菌ⅠT2菌株发酵液抑菌活性的影响

2.2.1 发酵时间

将5 mL的链霉菌ⅠT2菌株种子液接种至200 mL发酵培养基中，30 ℃，180 r/min振荡培养168 h，每隔24 h取一次样，使用杯碟法检测其发酵液的抑菌活性. 测定不同发酵时间的发酵液的抑菌圈直径，结果如图3所示.

图3 不同发酵时间对链霉菌ⅠT2菌株发酵液的抑菌活性的影响Fig.3 Effect of different cultured time on the antifungal activity of Streptomyces sp.ⅠT2 strain

在24～48 h的时间范围内，发酵液抑菌圈直径随时间增加而增大，在48～168 h的时间范围内，发酵液抑菌圈直径随时间增加而减小，表明链霉菌ⅠT2菌株具有较高的抑菌活性的发酵时间为48 h.

2.2.2 发酵转速

将5 mL的链霉菌ⅠT2菌株种子液接种至200 mL发酵培养基中，在30 ℃培养温度下，分别设置发酵转速为120、150、180、200、220 r/min振荡培养48 h后，使用杯碟法检测其发酵液的抑菌活性，测定不同发酵转速的发酵液的抑菌圈直径，结果如图4所示.

图4 不同发酵转速对链霉菌ⅠT2菌株发酵液的抑菌活性的影响Fig.4 Effect of different rotate speed on the antifungal activity of Streptomyces sp.ⅠT2 strain

在120～150 r/min的转速范围内，发酵液抑菌圈直径随转速的增加而增加；在150～220 r/min的转速范围内，发酵液抑菌圈直径随转速增加而减小，表明链霉菌ⅠT2菌株具有较高的抑菌活性的发酵转速为150 r/min.

2.2.3 发酵温度

将5 mL的链霉菌ⅠT2菌株种子液接种至200 mL发酵培养基中，分别设置发酵温度为23、26.5、30、33.5、37 ℃，150 r/min振荡培养48 h后，使用杯碟法检测其发酵液的抑菌活性. 测定不同发酵温度的发酵液的抑菌圈直径，结果如图5所示，在23～26.5 ℃的温度范围内，发酵液抑菌圈直径随温度的增加而增加；在26.5～30 ℃的温度范围内，发酵液抑菌圈直径大小随温度的增加无明显影响；在30～37 ℃的温度范围内，发酵液抑菌圈直径随温度的增加而减少，表明链霉菌ⅠT2菌株具有较高的抑菌活性的发酵温度为26.5～30 ℃.

2.3 链霉菌ⅠT2菌株发酵液的稳定性

2.3.1 热稳定性

将5 mL的链霉菌ⅠT2菌株种子液接种至200 mL发酵培养基中，于26.5 ℃，150 r/min振荡培养2 d后，取相同体积的发酵液，分别置于20、37、55、80、100 ℃水浴1 h，使用杯碟法检测其发酵液的抑菌活性. 测定不同温度处理的发酵液的抑菌圈直径，结果如图6所示，在20～55 ℃的温度范围内，随温度的增加，发酵液抑菌圈直径大小无明显变化；在55～100 ℃的温度范围内，发酵液抑菌圈直径随温度的增加而减少至0 mm，表明在20～55 ℃的温度范围内，链霉菌ⅠT2菌株发酵液具有较好的热稳定性.

2.3.2 酸碱稳定性

取于26.5 ℃，150 r/min振荡培养2 d后的链霉菌ⅠT2菌株发酵液，测定其pH值. 将发酵液pH值分别调整到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.7、9.0、10.0、11.0，室温放置12 h后将pH调至7.7，以未处理的发酵液为对照，使用杯碟法检测其发酵液的抑菌活性. 测定不同温度处理的发酵液的抑菌圈直径，结果如图7所示，在1.0～2.0的pH范围内，发酵液抑菌圈直径随pH值的增加而增大；在2.0～7.7的pH范围内，发酵液抑菌圈直径大小无明显变化；在7.7～11.0的pH范围内，发酵液抑菌圈直径随pH值的增加而减少至0 mm，表明在2.0～7.7的pH范围内，链霉菌ⅠT2菌株发酵液具有较好的稳定性.

图7 链霉菌ⅠT2菌株发酵液的酸碱稳定性Fig.7 pH stability of fermentation broth of Streptomyces sp. ⅠT2 strain

2.4 链霉菌ⅠT2菌株的attB位点的克隆与分析

以链霉菌ⅠT2菌株的总DNA为模板，用噬菌体ΦC31 的attB位点保守序列设计的一对引物attB1和attB2进行PCR扩增，得到一条大小为270 bp的DNA片段(图8). 对扩增的片段进行回收、测序，链霉菌ⅠT2菌株的attB 位点序列长277 bp．

M)DL2000 Maker；A)链霉菌ⅠT2菌株attB位点PCR扩增产物图8 链霉菌ⅠT2菌株attB位点的PCR扩增产物Fig.8 The amplification of attB site of Streptomyces sp.ⅠT2 strain

利用NCBI数据库对attB位点序列进行在线比对分析，结果如图9所示，链霉菌ⅠT2菌株的attB位点核心序列与多种链霉菌和小单孢菌的attB序列相似，与S.griseusM095的attB位点核心区域的序列相似度最高，达到97%，整个序列核心区高度保守，仅有少数的几个碱基发生变化.研究表明，来源于链霉菌噬菌体的ΦC31的整合酶基因与attP位点可与链霉菌基因组上的attB位点发生位点特异性重组，进而整合到宿主基因组中，获得稳定的遗传特性[12]，同时研究表明发生交换的核心序列为5′-TT[13]，链霉菌ⅠT2菌株的attB序列同样含有关键的5′-TT序列.

图9 链霉菌ⅠT2菌株attB位点序列与其他链霉菌和小单孢菌的对比Fig.9 Aligement of sequence of attB sites in Streptomyces sp.ⅠT2 strain and various species of Streptomyces and Micromonospora rosaria

2.5 链霉菌ⅠT2菌株与质粒pSET152之间位点特异性重组

质粒pSET152含有阿泊拉霉素抗性基因. 将制备好的受体ⅠT2菌株菌丝体与供体大肠杆菌混合，涂布于接合转移平板上，于30 ℃培养箱培养14 h后用抗生素覆盖培养基的表面，于30 ℃培养箱培养5 d后，获得阿泊拉霉素抗性接合转移子. 提取总DNA，以一对验证引物attL-F、attL-R，进行PCR扩增，可得到一条长度为353 bp的特异性片段(图10)，在链霉菌ⅠT2菌株中无法扩增得到这个特异性片段，在链霉菌ⅠT2菌株接合转移子中可扩增得到这个片段，表明质粒pSET152 通过attP位点与链霉菌ⅠT2菌株的染色体上的attB位点发生位点特异性重组．

M) DL2000 Marker； 1) 链霉菌ⅠT2菌株野生菌株；2) 链霉菌ⅠT2菌株接合转移子图10 链霉菌ⅠT2菌株接合转移子的验证Fig.10 Verification for apomycin-resistant conjugation transfer of Streptomyces sp. I T2 strain

3 结语

天然产物具有丰富的化学结构和生化特性，具备发现新型抗菌生物活性成分的巨大潜力[14].本研究以稻瘟病菌NO-1菌株为指示菌，对从神农架地区土壤中筛选出的1株链霉菌ⅠT2菌株进行了初步研究. 该菌株的琼脂菌块对稻瘟病菌NO-1菌株有良好的抑菌活性，抑菌圈平均直径为29.7 mm；经16S rDNA系统进化树分析，初步鉴定ⅠT2菌株为链霉菌属；测定不同培养条件对该菌株发酵液抑菌活性的影响，结果表明链霉菌ⅠT2菌株较适合的发酵条件为：发酵温度为26.5～30 ℃，发酵转速为150 r/min，发酵时间为48 h. 在该发酵条件下发酵液的抑菌活性较好，对稻瘟病菌NO-1菌株的抑菌圈直径达到了42.0 mm以上；利用PCR扩增获得了链霉菌ⅠT2菌株的attB位点序列，经生物信息学分析，该序列含有发生位点特异性重组所必须的核心位点5′-TT序列，同时利用pSET152质粒与链霉菌ⅠT2菌株进行链霉菌-大肠杆菌属间接合转移，获得了具有稳定的阿泊拉霉素抗性的链霉菌ⅠT2菌株接合转移子，表明质粒pSET152通过attP 位点与链霉菌ⅠT2 菌株的染色体上的attB 位点发生了位点特异性重组．