葡甘露聚糖-虾青素复合物的表征及对AFB1致肉鸡肝损伤的影响

汪文俊，王胜军，余诚，余程，向福

(1武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，中南民族大学 生命科学学院，武汉430074；2 湖北省武昌实验中学高二(9)班，武汉 430060 ；3大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，黄冈师范学院，黄冈 438000)

近年饲料、食品及其原料广泛受到霉菌毒素污染是一个全球性问题，黄曲霉毒素尤其是黄曲霉毒素B1(AFB1)的残留问题尤被关注[1].AFB1严重危害人畜生命和生产安全，对肝脏有特殊的亲和性，经肝脏代谢为毒性极强的AFB1-8,9-环氧化物(AFBO)等，影响动物生长性能、消化代谢、肉品质甚至导致死亡[2-4].

酵母细胞壁上富含的葡甘露聚糖(GM)是由甘露糖和葡萄糖通过β糖苷键连接而成的高分子多糖[5]，葡甘露聚糖对霉菌毒素有很强的吸附作用，能有效抵抗霉菌毒素的毒性[6-8].虾青素(3,3′-二羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮，ASTA)是一种重要的类胡萝卜素，有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性，因其优良的色素沉积作用并能促进动物发育，在饲料工业、养殖业及医药工业中应用广泛[9]，前期研究表明ASTA对AFB1引起的肉鸡肝损伤有显著改善作用，其与GM配合使用能显著地消除AFB1的毒害作用[10].

红法夫酵母富含ASTA和GM，本文从红法夫酵母中提取GM、ASTA，并将二者制备复合物，对提取物及其复合物进行了表征，并考察了其对AFB1致肉鸡肝损伤的影响.

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

全自动发酵罐(Biostat 5, B. Braun, Germany，工作体积为3 L)；傅里叶变换红外光谱仪(EQUINOX55型，德国Bruker)；热失重分析仪(NETZSCH STA 4493F3，耐驰科学仪器)；全自动生化分析仪(7020，日本日立).

1.2 菌种与培养条件

红法夫酵母4 ℃保藏于YM斜面.YM培养基：葡萄糖10 g/L、酵母浸粉3 g/L、蛋白胨5 g/L、麦芽汁3 g/L、琼脂20 g/L (用于制作平板时添加)，pH 5.0.发酵培养基：葡萄糖50 g/L、酵母浸粉8 g/L、KH2PO41.5 g/L、NaH2PO41 g/L、MgSO42 g/L，自来水配制，pH 5.0.斜面上挑取一环菌种于YM培养基中，培养过夜后种子液以10%(体积比)接种量接种到500 mL三角瓶(含有YM培养基50 mL)中，18 ℃、200 r/min下摇床振荡培养36 h制备种子液，将种子液按10%接种量接种到在5 L全自动发酵罐中于20 ℃、搅拌速度200 r/min、通气量为0.36 vvm下进行培养80 h.

1.3 GM、ASTA提取和复合物制备

GM和ASTA提取方法参见文献[11,12].将丙酮溶解的ASTA (100 mg/L)缓慢加入GM丙酮液[δ(ASTA∶GM)=1∶100]，同时剧烈搅拌30 min，室温挥发丙酮，得到GM-ASTA复合物.

1.4 红外光谱分析

将GM、GM-ASTA复合物、GM和ASTA物理混合物(两种物质按质量比1∶100的比例混合所得)经KBr压片，在红外光谱仪上4000～400 cm-1区间红外扫描.

1.5 热失重分析

准确称取GM、GM-ASTA复合物、GM和ASTA物理混合物20～25 mg，进行热失重分析，N2气氛，流速40 mL/min，升温速度20 ℃/min，温度范围20～600 ℃.

1.6 GM-ASTA复合物结合位点分析

利用Hyperchem软件模拟GM空间结构(力场: MM+，几何优化: Polak-Ribiere)，GM和ASTA结构如图1所示.利用frodock软件，基于范德华力、静电力和疏水作用力进行计算，预测GM和ASTA之间相互作用的可能性位点[13].

图1 ASTA和GM的分子结构Fig.1 The molecular structure of ASTA and GM

1.7 GM-ASTA复合物对AFB1致肉仔鸡肝损伤的影响

1.7.1 试验设计及基础日粮

1日龄商品代艾维茵肉仔鸡，正常饲料育雏10 d后，选取90只随机分为3个处理组，每个处理5个重复，每个重复6只鸡，具体如下：(1)对照组：正常玉米组；(2)AFB1饲料组：含有400 mg/kg AFB1；(3)复合物组：含有400 mg/kg AFB1+5 g/kgGM-ASTA复合物.为防止在饲养过程中饲料霉变，配料前所有玉米的含水率控制在12%以下，并于干燥、阴凉条件下存放.基础日粮配制见文献[14].

1.7.2 饲养管理

采用网上平养的方式，每笼6只，试验前将鸡舍、鸡笼进行彻底清扫，熏蒸消毒.于第7、21 日龄接种新城疫IV苗，28日龄接种法式囊疫苗.从第10 d正式开始试验，饲喂相应的饲粮.整个试验内，鸡自由采食和饮水.第1周室温控制在32～36 ℃，以后每周降低2 ℃，直至温度降至25 ℃，最后控制在22～25 ℃之间，相对湿度约55%～60%，饲养期为42 d.

1.7.3 肉鸡肝脏指标分析

于35日龄，每个重复随机选取体重相近的2只鸡，取肝脏中部约5 g，装入5 mL冻存管中，立即浸入液氮后置-80 ℃低温冰箱中保存，采用相关试剂盒测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD).取部分肝组织于10%中性福尔马林溶液中固定，进行组织病理学观察.经脱水、浸蜡、包埋、切片等处理步骤，再经苏木精-伊红染色，光镜下观察.

2 结果与分析

2.1 GM-ASTA复合物红外光谱

GM、GM-ASTA物理混合物、GM-ASTA复合物经KBr压片，在4000～400 cm-1区间进行红外光谱扫描，结果见图2.如图2所示,红外图谱中含有多个特征吸收峰[11]，在3420.1 cm-1处有强的O—H键的伸缩振动引起的特征吸收，在2936 cm-1和1393 cm-1处有两组糖类C—H的伸缩振动引起的特征峰，分别代表了糖类C—H伸缩振动与变角振动，1470 cm-1处为GM-ASTA复合物的—CH键因形成复合物而转向更低的波长，由于二者之间形成了氢键，在1641 cm-1处有C—O非对称伸缩振动峰，1073 cm-1处为O—H变角振动峰，红外光谱在1700～1775 cm-1范围内无吸收.

图2 GM-ASTA复合物红外光谱Fig.2 Infrared spectrum of GM-ASTA complex

2.2 GM-ASTA复合物热失重分析

GM、GM-ASTA物理混合物、GM-ASTA复合物在N2氛围下以20 ℃/min速度升温进行热失重分析，结果见图3.如图3所示：3种样品为两阶段热失重过程，第一阶段热失重温度区域几乎相同，在50～150 ℃之间，主要为样品吸附水分损失而形成的失重；而第二阶段的热失重主要为样品分解产生的失重，其中GM-ASTA复合物最稳定，热分解温度为275 ℃，较GM、GM-ASTA物理混合物的热失重温度250 ℃高了约25 ℃，表明在GM和ASTA之间发生某种作用而形成了GM-ASTA复合物，提高了其二次热失重的稳定性.此外，GM-ASTA两阶段的热失重率分别为62.22%和13.81%，表明复合物形成过程是按一定的比例进行的.

图3 GM-ASTA的热失重分析Fig.3 Thermo-gravimetric analysis of GM-ASTA

2.3 GM-ASTA复合物结合位点拟合分析

GM-ASTA复合物结合位点拟合分析计算共发现248个结果，其中相关性最高的结果见图4.如图4所示，ASTA结合在GM的两侧链间，不与乙酰基结合(从而不影响溶解性)，而是通过与侧链的C24，C25，O29等原子，和主链的C12、C13、C14、C20，C21，O14，O17、O18、O20等原子形成较强的范德华力和静电力而紧密结合.

a)骨架结构结合位点图; b) 分子结构结合位点图图4 GM与ASTA结合位点分析Fig.4 Binding site analysis of GM and ASTA

2.4 GM-ASTA复合物缓解AFB1致肉仔鸡肝损伤

2.4.1 GM-ASTA复合物对抗氧化水平的影响

肉鸡35日龄肝脏组织中SOD，MDA活性结果见表1.

表1 GM-ASTA复合物对肉鸡肝脏组织中SOD、MDA活性的影响
Tab.1 Effects of the GM-ASTA complex on the activitiy of SOD and MDA from broiler liver tissue

SOD/(U·mg-1)MDA/(nmol·mg-1) 298±19 4.81±0.53 AFB1 245±24∗ 5.29±0.90∗ GM-ASTA 286±48 4.47±0.51

*与对照组相比，P<0.05

由表1可见，AFB1污染饲料SOD活性较对照组显著降低(P<0.05)，MDA活性具有增加的趋势，但差异不显著(P>0.05)，表明AFB1污染饲料可降低肝脏的抗氧化能力.与AFB1污染饲料组和对照组相比，GM-ASTA复合物组SOD和MDA活性差异均不显著(P>0.05)，表明GM-ASTA吸附剂缓解了发霉饲料所致抗氧化能力的下降.

不同试验组肉鸡肝脏组织病理学结果如图5所示.由图5a中对照组肝脏中央静脉结构清楚，肝细胞大小一致，胞核、胞浆清晰；图5b中AFB1组脂肪变性肝细胞较多，局部红细胞略变，部分胞浆内有不清晰的小泡，间结成分少，部分存在淋巴细胞小结，局部红细胞脂变，间质内管道系统上皮细胞增生，增生结节更明显；而图5c中GM-ASTA组基本结构清晰一致，少量淋巴细胞小结淤血，部分肝细胞轻度变性，有个别轻度脂变，未见明显异常.说明GM-ASTA具有较好的AFB1解毒能力.

a)对照组; b) AFB1组; (c) GM-ASTA+AFB1组图5 不同试验组肉鸡肝脏组织病理学Fig.5 Broiler liver histopathology under different treatments

3 讨论

研究表明酵母细胞壁中GM对霉菌毒素有很强的吸附作用，能有效抵抗霉菌毒素的毒性[7-9]，前期研究表明GM和ASTA共同作用能有效地降低AFB1毒性，缓解AFB1诱导的肉鸡肝损伤，效果与对照物污染饲料组无显著差异，对AFB1有明显的吸附作用并具有解毒效果[11].多糖分子与小分子之间往往通过静电引力、范德华力或疏水作用发生相互作用而形成复合物[15,16].如能将GM和ASTA制备成复合物，用于AFB1的吸附解毒，会有良好的效果.为此本文采用红外光谱、TGA分析及分子对接模拟研究从红法夫酵母提取的GM、ASTA制备的GM-ASTA复合物，证明ASTA和GM主链通过范德华力和静电力紧密结合而形成了复合物, 复合物中GM、ASTA结合较稳定.

AFB1中毒的症状包括肝组织中出现大的脂肪空泡聚集在核的周围，对肉鸡的肝脏造成中度至重度水肿和肝细胞脂肪化[9].本实验中AFB1饲料组导致明显的脂肪变性、淋巴细胞增生和血管充血，表明AFB1对肝组织造成了损伤，GM-ASTA复合物组基本正常，其缓解程度与血液生化指标和抗氧化水平结果相一致，说明GM-ASTA复合物能显著的改善AFB1导致的肉鸡肝损伤，其具有吸附AFB1并解除其毒性的双重功效.