姜黄素对高氧诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的保护作用及机制

方恩容，杨 凯，何 杰，邱 静，黄 娜

成都医学院第一附属医院 呼吸内科(成都 610500)

采用高于生理浓度的氧(高氧)吸入所进行的氧疗是成人急性呼吸窘迫综合症等严重呼吸道疾病进行机械通气时的常规治疗手段[1]。尽管氧疗可改善组织缺氧和提高呼吸窘迫综合征患者的生存率，但是高氧也可引发氧中毒，包括急性肺损伤[2-4]。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell,AEC2)作为祖细胞，不仅可以实现自我更新，而且可转分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞(alveolar type I epithelial cell,AEC1)，在肺泡上皮细胞层的维护和损伤修复中发挥着重要作用[5]。但是，高氧被证实可促进AEC2细胞凋亡[6]和向AEC1过度转分化[7]。β-catenin作为Wnt信号途径中的关键分子，可转入细胞核而激活Wnt靶基因转录，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要作用。同时，β-catenin也能与转录共激活因子p300及其他成分结合，形成活性转录激活复合物。β-catenin/p300的这种相互作用不仅与胚肺上皮发育相关[8]，而且对气道组织干细胞分化也有影响[9]。但是，β-catenin/p300相互作用与高氧诱导AEC2损伤的关系目前并不清楚。

姜黄素是从姜科、天南星科植物根茎中提取的重要活性化学成分，被证实对各类肺病如缺血-再灌注性损伤[10]、急性肺损伤[11]和慢性阻塞性肺病[12]都有一定保护作用。另外，姜黄素对高氧诱导的新生鼠肺损伤具有保护作用[13]。但是，至今并不清楚姜黄素能否保护高氧诱导下的AEC2损伤。本研究目的是在高氧诱导AEC2损伤的细胞模型中，观察姜黄素对高氧诱导AEC2损伤的改善作用，探讨β-catenin/p300的相互作用与姜黄素改善高氧诱导AEC2损伤作用的关系，为姜黄素在急、慢性肺损伤性疾病防治的临床应用中提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

健康雄性SD大鼠(体重180～200 g)，由北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]提供。胰蛋白酶、胶原酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、姜黄素、β-catenin/p300交互作用的特异抑制剂IQ-1(美国Sigma公司)；胎牛血清、DMEM(美国Gibco公司)；抗p300、抗β-catenin、抗GAPDH抗体(英国Abcam 公司)；抗水通道蛋白-5(AQP5)、抗表面活性物质蛋白C(SP-C)抗体(美国Santa Cruz 公司)；CCK-8检测试剂盒(碧云天生物技术公司)；Trizol 和M-MLV 逆转录酶(美国Promega 公司)；p300 siRNA由锐博生物公司合成，转染试剂Lipofectamine 2000购自英韦创津公司。

1.2 AEC2分离、培养

参照Dobbs 等[14]方法，分离原代培养AEC2。实验用溶液Ⅰ、Ⅱ配置方法参考文献[14]。SD大鼠麻醉、气管插管、放血处死，快速经右心室穿刺插管至肺动脉，经肺动脉输注溶液Ⅱ至肺循环，直至全肺变苍白色，以去除血细胞；溶液Ⅰ、Ⅱ经气管插管灌洗肺泡分别为8次和2次，以去除肺泡内的巨噬细胞。经气管插管注入混合消化液(含0.25%胰蛋白酶和0.02%胶原酶)10 mL，取出心肺和气管，37 ℃保留消化25 min。直接将肺组织剪取，放置含脱氧核糖核酸酶I的小烧杯中，仔细剪碎肺组织。加入胎牛血清以灭活胰酶作用，经200目滤网过滤，离心，细胞经DMEM重悬加入培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养1 h后，收集未贴壁细胞，DEME重悬，计数后调整细胞数接种于50 mL培养瓶(部分瓶中放置细胞爬片)中，继续培养20 h，贴壁细胞经碱性磷酸酶染色法鉴定，90%为AEC2细胞。

1.3 分组处理

细胞随机分为对照组、高氧组、姜黄素组(分为高、中、低剂量3个亚组)、IQ-1组、p300 siRNA组、siRNA阴性对照组。高氧诱导AEC2损伤模型制备参照文献[15]。对照组直接置于5%CO2培养箱中培养24 h；其他各组通95%O2/5%CO2高纯混合气(3 L/min)10 min后，密封，置培养箱中培养24 h，收集细胞用于检测。在培养结束前，采用测氧仪(CYS-1型上海嘉定学联仪表厂，中国)检测各培养瓶中氧浓度，通高氧的各组样本如其氧浓度低于90%即舍弃。高、低剂量姜黄素组在通氧前30 min时，培养瓶中加入含姜黄素(终浓度分别为40、10、2 μmol/mL)的DMEM培养液。IQ-1组通氧前30 min时，培养瓶中加入含IQ-1(终浓度为20 μmol/L)的DMEM培养液。p300 siRNA组、siRNA阴性对照组通氧前30 min时，培养瓶中加入含p300 siRNA脂质体(50 nmol/L)或等量转染溶剂Lipofectamine 2000的DMEM培养液。正常对照组、高氧组通氧前30 min时，培养瓶中加入含等容积溶剂的DMEM培养液。药物处理结束后，各组弃去培养基，胰酶消化、重悬细胞后，取2 μL细胞混悬液加至血细胞计数板中，计数各组细胞数目。

1.4 CCK-8法检测AEC2细胞活力

药物处理过程完成后，收集各组AEC2细胞，以2×106个细胞/孔接种于96孔培养板，继续培养8 h使细胞贴壁，每孔加10 μL CCK-8液，继续培养2 h，酶标仪(美国Bio-Tek公司)检测450 nm处吸光值。

1.5 荧光定量PCR检测目的基因mRNA

药物处理过程完成后，提取细胞总RNA，测定浓度后，每组样本取1 μg RNA进行逆转录，合成的cDNA在ABI 7000 型荧光定量PCR 仪(美国Applied Biosytems)中进行扩增。所用引物序列为：SP-C正义链 5'-GTCGTCGTGGTGATTGTAGG G-3'，反义链5'-GAAGGTAGCGATGGTGTCTG-3'；AQP5正义链 5'-CTTATCTCTCCCAACCCAG-3'，反义链5'-CCCATCCTTGACCAGAAAT-3'；GAPDH正义链 5'-GTGCCAGCCTCGTCTC ATAG-3'，反义链5'-GAACTTGCCGTGGGTA GAGTC-3'。反应条件如下：预变性94 °C 5 min，变性94 °C 30 s，退火60 °C 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35次循环。扩增产物大小经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实。以GAPDH为内参，目的基因与GAPDH扩增条带灰度比值作为目的基因mRNA相对表达量。

1.6 流式细胞双标记法检测转分化细胞亚类

AQP5和SP-C分别是AEC1和AEC2的特征性表型蛋白，对二者的检测可以作为这两种细胞类型的标志[16-17]。为此，本研究在流式细胞仪中通过检测AQP5、SP-C阳性细胞数，验证AEC2向AEC1转分化的变化。药物处理过程完成后，用0.25%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，1 000 r/min，离心半径10 cm，离心5 min，PBS洗涤，离心，舍弃上清液，加75%冷乙醇固定2 h。再离心，弃上清液，PBS洗涤后,调整细胞浓度至1 ×108个细胞/L。然后，加入羊抗鼠AQP5抗体、兔抗鼠SP-C抗体(稀释倍数1∶100)，室温下孵育60 min，PBS洗涤，加FITC标记的抗羊IgG二抗、Cy3标记的抗兔IgG二抗,室温避光孵育20 min,上流式细胞仪(FACS CantoTMII，BD，美国)检测。利用Flow Jo软件作图，将细胞分为4 个亚群：Q1，AQP5(+)/SP-C(-)；Q2，AQP5(+)/SP-C(+)；Q3，AQP5(-)/SP-C(-)；Q4，AQP5(-)/SP-C(+)，结果以阳性细胞的百分率表示(n=5)。其中，Q1亚群即为AEC1细胞，Q4亚群即为AEC2细胞，Q2为AEC2向AEC1转分化的中间型。

1.7 Western blot 检测相关蛋白表达量

药物处理过程完成后，收集并抽提各组细胞的总蛋白，利用BCA 法测定总蛋白浓度。每个泳道上样50 μg蛋白样品，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白转移至PVDF 膜，加Tris缓冲液-吐温(TBST)及牛奶液封闭 1 h，加一抗(抗p300、抗β-catenin、抗GAPDH，抗体稀释倍数1∶500～1∶1 000)4 °C孵育过夜，TBST洗脱，HRP 联接的二抗(稀释倍数1∶500)孵育1 h，TBST 再洗脱等步骤，最后，增强化学发光法探测蛋白条带，经显影处理，获得清晰条带。利用Image J软件分析各条带的灰度值。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 姜黄素对AEC2细胞增殖活力及细胞计数影响

CCK-法检测显示，与对照组比较，高氧组AEC2细胞增殖活力和细胞计数明显减低(P<0.01)；与高氧组比较，高、中剂量姜黄素组AEC2细胞增殖活力和细胞计数均明显增大(P<0.01)；与高氧组比较，IQ-1组也能明显提升AEC2细胞增殖活力和细胞计数(P<0.01)；与对照组比较，siRNA阴性对照组AEC2细胞增殖活力和细胞计数均明显减低(P<0.01)；与siRNA阴性对照组比较，p300 siRNA组AEC2细胞增殖活力和细胞计数也明显增加(P<0.01)(图1)。基于上述姜黄素剂量与AEC2细胞增殖活力、细胞计数的关系，后续实验中的姜黄素治疗组均只采用了高剂量姜黄素治疗组。

图1 姜黄素对AEC2细胞增殖活力及细胞计数的影响注：A：CCK-8 法检测的AEC2细胞活力；B：细胞计数板所计数的细胞总数；Ctrl：对照组；Mod：高氧组；Cur2：低剂量姜黄素治疗组；Cur10：中剂量姜黄素治疗组；Cur40：高剂量姜黄素治疗组；IQ-1：IQ-1组；blank siRNA：siRNA阴性对照组；p300 siRNA：p300 siRNA组；与对照组比较，*P<0.01；与高氧组比较，#P<0.01；与siRNA阴性对照组比较，&P<0.01

2.2 姜黄素对高氧诱导AEC2细胞转分化的影响

荧光定量PCR检测显示，与对照组比较，高氧组AEC2标记基因SP-C mRNA表达明显减少(P<0.01)，AEC1标记基因AQP5 mRNA表达明显增强(P<0.01)；与高氧组比较，高剂量姜黄素组SP-C mRNA表达明显增强(P<0.01)，AQP5 mRNA表达明显减小(P<0.01)；与高氧组比较，IQ-1组明显增加SP-C mRNA表达(P<0.01)，减少AQP5 mRNA表达(P<0.01)；与对照组比较，siRNA阴性对照组SP-C mRNA表达明显减少(P<0.01)，AQP5 mRNA表达明显增强(P<0.01)；与siRNA阴性对照组比较，p300 siRNA组SP-C mRNA表达增强(P<0.01)，AQP5 mRNA表达减小(P<0.01)(图2)。

流式细胞双标记法检测显示，与对照组比较，高氧组AEC1百分比、AEC2向AEC1转分化的中间型细胞百分比均明显增大(P<0.01)，AEC2百分比明显减少(P<0.01)；与高氧组比较，高剂量姜黄素组、IQ-1组AEC1百分比、转分化中间型细胞百分比减少(P<0.01)，AEC2百分比明显增大(P<0.01)；与对照组比较，siRNA阴性对照组AEC1百分比、AEC2向AEC1转分化的中间型细胞百分比均明显增大(P<0.01)，AEC2百分比明显减少(P<0.01)；与siRNA阴性对照组比较，p300 siRNA组AEC1百分比、转分化中间型细胞百分比减少(P<0.01)，AEC2百分比明显增大(P<0.01)(图3～4)。

图2 姜黄素对SP-C、AQP5 mRNA表达的影响注：A：AEC2标记基因SP-C mRNA表达量；B：AEC1标记基因AQP5 mRNA表达量；Ctrl：对照组；Mod：高氧组；Cur40：高剂量姜黄素治疗组；IQ-1：IQ-1组；blank siRNA：siRNA阴性对照组；p300 siRNA：p300 siRNA组；与对照组比较，*P<0.01；与高氧组比较，#P<0.01；与siRNA阴性对照组比较，&P<0.01

图3 姜黄素对AEC2细胞转分化的影响注：A：对照组(Ctrl)；B：高氧组(Mod)；C：高剂量姜黄素治疗组(Cur40)；D：IQ-1组(IQ-1)；E：siRNA阴性对照组(blank siRNA)；F：p300 siRNA组(p300 siRNA)

图4 姜黄素对AEC细胞各亚型百分比的影响注：A：AEC2细胞百分比；B：AEC1细胞百分比；C：转分化中间型细胞百分比；Ctrl：对照组；Mod：高氧组；Cur40：高剂量姜黄素治疗组；IQ-1：IQ-1组；blank siRNA：siRNA阴性对照组；p300 siRNA：p300 siRNA组；与对照组比较，*P<0.01；与高氧组比较，#P<0.01；与siRNA阴性对照组比较，&P<0.01

2.3 姜黄素对β-catenin/p300表达量的影响

Western blot 检测显示，与对照组比较，高氧组β-catenin、p300蛋白表达量明显增加(P<0.01)；与高氧组比较，高剂量姜黄素组β-catenin、p300蛋白表达量明显减少(P<0.01)(图5)。

图5 姜黄素对β-catenin/p300表达量的影响注：A：β-catenin蛋白表达量；B：p300蛋白表达量；Ctrl：对照组；Mod：高氧组；Cur40：高剂量姜黄素治疗组；与对照组比较，*P<0.01；与高氧组比较，#P<0.01

3 讨论

高氧引起肺损伤的主要特征包括内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤、过度炎症反应以及肺泡水肿[18-20]。高氧吸入治疗时，肺泡上皮细胞(包括AEC1和AEC2)作为肺泡壁的最内层细胞，通过液气界面直接接触高氧刺激，而易于产生氧化应激性损伤[21]。其中，AEC2也被证实是高氧肺损伤的主要靶细胞[6,22-23]。高氧可抑制AEC2增殖，促进AEC2凋亡增加[6]，促进AEC2过度转分化为AEC1[7]。本研究结果所示，高氧的损伤作用显然会减少肺泡壁AEC2的数量，导致肺表面活性物质分泌不足，增加肺泡表面张力，影响肺泡通气、换气功能。因此，对成人呼吸窘迫综合征给予氧疗的同时，应采取合理干预措施以预防和治疗患者高氧诱导的肺损伤，包括靶向调控和保护AEC2。

中药因其作用温和、副作用小等优点，一直为各类肺病研究者所关注。姜黄素中药活性成分对脂多糖、缺血再灌注、机械通气等病因诱导的肺损伤有一定保护作用[11,24-25]。有研究[13]显示，姜黄素对高氧诱导肺损伤具有保护作用，但是其保护性作用的细胞学机制目前并不清楚。因此，本研究观察了姜黄素对高氧诱导AEC2损伤的影响，结果显示，姜黄素明显改善高氧作用下AEC2的增殖活力，抑制AEC2转分化为AEC1的过程，增加AEC2数量。姜黄素对AEC2的这些作用构成其保护高氧诱导肺损伤的细胞学基础。

Wnt信号途径主要成分β-catenin与转录共激活因子p300相互作用，在肺组织发生发育中可能发挥着重要作用。β-catenin/p300相互作用不仅促进气道黏液细胞分化[9]，而且参与AEC2、气管上皮细胞的分化[26]。抑制β-catenin/p300相互作用则抑制小鼠胚肺上皮远侧分支化，促进上皮近侧分支化[8]。本研究结果显示，高氧激活β-catenin/p300相互作用，促进AEC2转分化为AEC1，同时降低AEC2活力，减少AEC2细胞数量；应用β-catenin/p300相互作用的抑制剂IQ-1或siRNA干扰p300表达，则能逆转高氧的这些作用。由此可见，尽管β-catenin/p300相互作用在正常肺组织上皮细胞分化中起着重要作用，但是高氧诱导下β-catenin/p300相互作用的过度激活也可能通过影响肺泡壁AEC2数量与功能而促进肺损伤。本研究中，姜黄素处理能抑制高氧诱导对AEC2的损伤作用，包括抑制AEC2过度转分化、增强AEC2的增殖活力和增加AEC2数量。同时，姜黄素处理也抑制β-catenin、p300的蛋白表达，这提示姜黄素对高氧诱导AEC2损伤的保护作用机制与其抑制β-catenin/p300相互作用有关。