miR-143在卵泡刺激素介导的卵巢颗粒细胞孕酮生成中的作用

高小博，姚楠，2，郑盼盼，2，骆海燕，马旭，陆彩玲，2*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所遗传优生中心，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100005)

颗粒细胞是卵泡的重要组成部分，围绕在卵母细胞周围为其提供营养并参与卵泡的发育。颗粒细胞也是女性性激素(主要包括甾体激素雌激素和孕酮)的主要来源，这些性激素调控了正常的月经周期和生殖，因此颗粒细胞的增殖和分化是女性拥有正常生育功能的必要因素[1]。在卵泡刺激素(FSH)的刺激下，颗粒细胞增殖、分化以及具有了合成甾体激素的能力[2]。

miRNAs是一类长约22nt的非编码的单链RNA分子，广泛存在于线虫、植物、动物及人类的细胞中。miRNA作为基因转录后水平的调控因子，主要以碱基配对的方式结合到靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)，通过抑制或促进翻译或降解mRNA的方式进行转录后调控[3-4]。miR-143是一个高度保守的miRNA，在血管损伤和重构[5]、血液肿瘤发生和发展[6]、脂肪分泌及能量代谢[7]和调控神经功能[8]等方面扮演重要角色。近年来，随着对miRNA的深入研究，发现miRNA在颗粒细胞增殖和甾体激素分泌中具有广泛的调节作用。本课题组前期研究发现，miR-143主要分布于小鼠卵巢的卵泡颗粒细胞中，随着卵泡的发育miR-143在初级和次级卵泡中的表达水平较高[9]。Zhang等[10]证明在FSH介导的小鼠颗粒细胞中，miR-143沉默显著促进颗粒细胞的增殖，并且miR-143抑制剂在翻译和翻译后水平上调3β-羟基固醇脱氢酶(3β-HSD)、芳香化酶(CYP19A1)、17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD1)等甾体激素合成相关基因的表达。然而，miR-143对FSH颗粒细胞孕酮生成的影响未见报道，本文进行了miR-143对FSH诱导颗粒细胞产生孕酮的作用研究。

材料和方法

一、实验材料

反转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)，RNA提取试剂Trizol(美国Thermo Fisher Scientific公司)，DMEM/F12液体培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)，对照重组腺病毒Ad-miRNC和过表达miR-143的重组腺病毒Ad-miR143均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，miR-143 TaqMan MicroRNA Assays(美国Thermo Fisher Scientific公司)，碘[125I]孕酮放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所有限公司)。CO2恒温细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，ABI Prism 7500实时定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，TC-512梯度PCR仪(英国Techne公司)，xh6080放免仪(西安核仪厂)。

二、研究方法

1.原代颗粒细胞培养：21日龄的雌性SD大鼠购自于维通利华公司，本研究所有实验均按照《实验动物护理与使用指南》的要求进行。每只SD大鼠腹腔注射20 U的孕马血清(PMSG)饲养48 h后，颈椎脱臼处死并在无菌条件下取出双侧卵巢，剔除卵巢被膜及周围组织，用1 ml注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞释放出来，将颗粒细胞重悬于含15%FBS的DMEM/F12培养基中，并以合适的密度接种于细胞培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，以备后续处理。

2.颗粒细胞RNA提取：取35 mm培养皿中经过不同处理的原代颗粒细胞，弃培养液后加入PBS洗2次，吸去PBS后加入RNA提取试剂Trizol，充分吹打至细胞完全裂解后，利用苯酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀的方法提取RNA。

3.颗粒细胞miRNA实时定量RT-PCR检测：miR-143实时定量RT-PCR检测根据Applied Biosystems公司的TaqMan MicroRNA Assays试剂盒进行检测，首先采用茎环结构的特异性引物进行逆转录，然后再采用miR-143特异性的TaqMan探针进行检测。

4.病毒感染及FSH处理：原代颗粒细胞在含有15%FBS的DMEM/F12培养基中培养过夜，12 h后，DMEM/F12清洗细胞2～3次，洗去未贴壁的细胞，每个35 mm培养皿中加入1.5 ml含有10%FBS、无抗生素的DMEM/F12培养基，以3×1011粒子/ml的腺病毒感染颗粒细胞，于CO2培养箱内培养5 h，随后将培养基换为无血清、无抗生素的DMEM/F12培养基，于CO2培养箱内培养24 h，加入含有50 ng/ml FSH的无酚红DMEM/F12培养基处理感染后的颗粒细胞。

5.放射免疫法测定孕酮：24孔板每孔中加入约5×105个颗粒细胞，用500 μl含15%FBS的DMEM/F12培养基于37℃、CO2培养箱内培养，然后进行相应处理。培养结束后收集细胞上清200 μl，储存于-20℃，按照孕酮放射免疫分析试剂盒说明书测定孕酮的水平。

三、统计学分析

结 果

一、FSH诱导原代颗粒细胞分泌孕酮模型的建立

分离大鼠原代颗粒细胞后用生理盐水和50 ng/ml的FSH分别处理24 h，通过放射免疫测定技术(RIA)分析FSH刺激颗粒细胞后的孕酮水平，结果显示FSH处理细胞后孕酮水平显著增加(P<0.001)(图1)。

注：与生理盐水处理组比较，***P<0.001图1 FSH诱导颗粒细胞分泌孕酮结果

二、FSH对原代颗粒细胞miR-143表达的影响

用50 ng/ml的FSH分别处理原代颗粒细胞0、6、12、24和48 h后，应用实时定量RT-PCR方法检测miR-143的表达量，以U6 snRNA的表达水平为内参，结果发现miR-143在FSH处理颗粒细胞6、12 h后表达没有显著变化，在24 h后表达显著增加(P<0.01)，在48 h时表达量最高(P<0.001)(图2)。

注：与未经FSH处理组比较，**P<0.01，***P<0.001图2 FSH对原代颗粒细胞miR-143表达的影响

三、重组腺病毒过表达miR-143的鉴定

用对照重组腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分别感染原代颗粒细胞后，通过实时定量RT-PCR方法检测细胞内miR-143过表达水平，以U6 snRNA为内参。结果显示，与对照Ad-miRNC组相比，感染Ad-miR143组的细胞miR-143表达水平显著增加(P<0.01)(图3)。

注：与对照重组腺病毒Ad-miRNC组比较，**P<0.01图3 重组腺病毒Ad-miR143感染细胞后的miR-143表达结果

四、过表达miR-143对颗粒细胞孕酮分泌水平的影响

用对照重组腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分别感染原代颗粒细胞后，加入50 ng/ml FSH再处理细胞24 h后，收集细胞上清检测孕酮水平。结果表明，未经FSH处理的各组之间孕酮分泌水平没有显著差异。经FSH处理与未经FSH处理比较，各组孕酮分泌水平显著升高(P<0.001)，且感染Ad-miR143组与空白对照组和对照腺病毒组相比，孕酮分泌水平显著升高(P<0.01)(图4)。

注：与未经FSH处理组比较，***P<0.001；与对照重组腺病毒Ad-miRNC组比较，##P<0.01图4 miR-143过表达增加FSH刺激的颗粒细胞孕酮分泌

讨 论

FSH受体(FSHR)是视紫红素样G蛋白偶联受体家族的成员，特异性表达于卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞。FSHR以细胞内侧的C末端结束，该末端包含受体的重要功能模体[11]。FSH促进卵泡的募集，支持腔卵泡的生长、成熟和选择，通过与颗粒细胞上FSHR结合激活一系列信号级联引发优势卵泡排卵的生物学功能[12]。FSH与颗粒细胞上的FSHR结合，激活腺苷酸环化酶，提高细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平，并激活蛋白激酶A(PKA)，然后PKA可以直接磷酸化调节转录相关蛋白质包括Y盒结合蛋白1(YB-1)、组蛋白H3、cAMP响应原件结合蛋白(CREB)、β-连环蛋白(β-catenin)等，也可以间接激活以转录和翻译为主要调控目标的信号转导级联，进而促进颗粒细胞增殖和甾体激素的合成[13]。

哺乳动物卵泡形成是一个复杂的过程，FSH是卵泡在窦期以后正常发育的关键，是卵泡存活的主要因素，通过激活多种信号通路调节卵泡成熟所需的基因[14]。卵泡发育过程伴随颗粒细胞增殖和分化以及甾体激素的分泌。我们课题组前期用FSH处理KK-1颗粒细胞系，利用Northern blot方法检测发现10 ng/ml FSH抑制了miR-143、let-7a、miR-125b的表达，提示FSH在颗粒细胞中的作用受miRNA的调控[9]。在本研究中，我们利用50 ng/ml FSH处理原代颗粒细胞，发现FSH处理24、48 h后上调miR-143的表达，这种差异可能与细胞类型和FSH处理剂量不同有关。张建芳等[15]利用原位杂交和实时定量PCR检测小鼠卵巢，发现miR-143在颗粒细胞中的表达量约为卵母细胞中表达量的20倍，主要定位于各级卵泡的颗粒细胞。随后他们证明从性交后15.5 d到产后4 d原始卵泡形成过程中，miR-143表达增加，原位杂交结果显示miR-143定位于前颗粒细胞，并通过抑制前颗粒细胞增殖和下调细胞周期相关基因的表达来抑制原始卵泡的形成，表明miR-143对原始卵泡的形成至关重要[16]。这些研究提示miR-143通过调节颗粒细胞的增殖和功能参与卵泡的发育。Du等[17]发现FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通过靶向下调FSHR的表达，降低细胞内PKA和AKT等信号分子水平，诱导猪颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁，研究进一步发现TGFβ信号分子SMAD4通过直接与miR-143的启动子结合抑制miR-143的表达，从而正向调控FSHR的表达来参与颗粒细胞和卵泡发育调控。Zhang等[10]发现在小鼠卵巢中miR-143表达于初级、次级和窦性卵泡的颗粒细胞，并证明在FSH介导的小鼠颗粒细胞中miR-143沉默显著增加雌二醇的产生和促进颗粒细胞的增殖，并且miR-143通过靶向调控KRAS实现对甾体激素合成相关基因的表达调控作用。Zhang等[18]证明在牛卵巢颗粒细胞中FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通过下调FSHR的表达减少孕酮的合成和雌二醇的分泌。本研究发现miR-143过表达促进FSH介导的卵巢颗粒细胞孕酮的合成，提示FSH可能通过调控miR-143的表达调控颗粒细胞的功能。我们的结果进一步丰富了FSH对miRNA以及miRNA对颗粒细胞孕酮合成的调控。

综上所述，本研究表明miR-143能够促进FSH介导的卵巢颗粒细胞孕酮的分泌。我们将在上述研究的基础上，探索miR-143调控孕酮生成的分子机制以及与FSH调控孕酮生成的其他已鉴定通路的关系，进一步揭示miR-143在卵巢颗粒细胞功能调控中的作用。