改良荧光染色法在皮下真菌病组织病理诊断中的应用分析

刘晓雨 梁官钊 郭健 段昕所 李保强 徐伊 王淑新 陆洁

1承德医学院附属医院皮肤科，河北 067000；2中国医学科学院 北京协和医学院皮肤病医院真菌科，南京 210042

皮下真菌病往往需通过组织病理检查来确诊，传统的染色方法主要有苏木精-伊红（HE）、过碘酸-雪夫（PAS）和六铵银（GMS）染色法，这些方法操作步骤繁琐、耗时长、标本易污染，渐难以满足日益增加的临床需求［1-2］。随着荧光显微镜的普及，Calcofluor White（CFW）荧光染色剂开始被应用于真菌染色［3］。CFW 荧光染色剂有助于快速、灵敏、特异地检出真菌，目前主要应用于涂片标本的直接镜检［3-4］，尚无用于皮下真菌病组织病理诊断的相关研究。本研究创新性地将CFW染色应用于皮下真菌病的组织病理诊断，通过比较改良CFW 荧光染色法、HE染色法、PAS染色法和GMS染色法检测皮下真菌病真菌的阳性率，分析改良CFW 荧光染色法在皮下真菌病组织病理诊断中的应用价值，为皮下真菌病的诊断提供一种新的方法。

对象与方法

一、对象

回顾1987—2017年承德医学院附属医院收治的21例皮下真菌病患者，其中女7例，男14例。感染部位位于头面部2 例，上肢14 例（手部10 例，前臂4例），下肢5例（足背1例，腿部4例）。感染菌种为孢子丝菌12例，着色芽生菌3例，念珠菌1例，石膏样癣菌1例，毛霉菌1例，菌种不明3例。所有患者均进行过组织病理检查。纳入标准：①住院期间疑诊为真菌感染，切取局部活组织和组织病理诊断并留有病理组织蜡块；②病理组织蜡块中组织保留较多，能够切取足量可用切片；③住院期间在切取组织相同部位取皮下组织行真菌培养阳性或组织病理切片行HE、PAS、GMS染色中任意一种染色真菌阳性。

二、主要试剂

0.1%CFW 工作液（美国Sigma 公司），HE 染色剂（珠海贝索生物技术有限公司），PAS 染色剂（北京雷根生物技术有限公司），GMS染色剂（珠海贝索生物技术有限公司）。阴性对照染色剂为10%KOH（天津永大化学试剂有限公司）。

三、方法

收集的石蜡包埋组织进行平行试验，每块组织连续切 4 张 4 μm 切片，1 张行改良 CFW 荧光染色，另3 张分别按常规行HE 染色、PAS 染色和GMS染色。

改良CFW荧光染色：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水稍洗，切片晾干；滴加CFW 荧光染色液，避光染色10 min；倾去染液，蒸馏水稍洗，行常规HE染色；蒸馏水稍洗，常规脱水、透明、中性树胶封固，荧光显微镜下镜检。

阴性对照：以蒸馏水代替荧光染色液及KOH溶液，其余步骤同改良CFW荧光染色。

四、结果判定

改良CFW 染色阳性：荧光显微镜下菌丝及孢子呈亮蓝色，高倍镜下或可见菌丝分隔，背景黑暗。HE 染色阳性：可见真菌孢子呈椭圆形。PAS染色阳性：真菌孢子呈椭圆形，孢子壁呈现红色或紫红色；真菌菌丝呈现红色或紫红色，菌丝不完整，呈节段性。GMS 染色阳性：细胞和组织背景为红色，真菌孢子、菌丝呈黑褐色或棕褐色，孢子圆形或椭圆形。

五、统计学方法

采用SPSS 19.0软件，4种染色法诊断真菌感染阳性率比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、4种染色方法检出皮下真菌病的阳性率

21 例皮下真菌感染患者中，培养阳性17 例（80.95%），改良CFW 荧光染色法检出阳性14 例（66.67%），HE 染色法阳性5例（23.80%），PAS 染色法阳性 6 例（28.57%），GMS 染色法阳性 11 例（52.38%）。改良CFW 荧光染色法阳性率高于HE染色（χ2= 6.718，P= 0.012）和 PAS 染色法（χ2=5.200，P= 0.029）。改良 CFW 荧光染色法与 GMS染色法阳性率差异无统计学意义（χ2= 0.693，P=0.530）。

二、4种染色方法的镜下表现

在紫外激发光（紫外线滤镜）下，经改良CFW染色法染色，孢子丝菌、念珠菌及未知菌种感染皮下组织中可见呈亮蓝色菌丝及孢子，背景黑暗，真菌的形态特征清晰、明显，阴性对照组背景黑暗，无荧光反应（图1）。1份标本HE、PAS、GMS染色均呈阴性，而改良CFW染色法呈阳性（图2）。在4种染色方法均为阳性的4份标本中，改良CFW染色法与其余染色方法相比，真菌形态特征更清晰，与背景反差更明显（图2）。

着色芽生菌在HE、PAS、GMS染色法中可以相对容易找到，使用改良CFW 荧光染色法在紫外激发光下隐约可见硬壳小体的黑色轮廓，并非亮蓝色。见图2。

讨 论

深部真菌感染患者病死率随治疗开始时间的滞后而增高，及早给予经验治疗能挽救更多患者的生命，因此真菌感染的早期诊断是抗真菌治疗成败的关键［5］。在组织中判断是否存在真菌感染，主要依靠病理石蜡切片的HE 染色及其他特殊染色，如GMS 及PAS 染色，再结合形态学进行判断。HE 染色虽能显示真菌本身颜色和周围组织结构，但难以形成明显对比，尤其对无色真菌的辨认较差。GMS染色法涉及的试剂品种繁多，且染液需即用即配，染色过程繁复，如过染会导致其他组织成分着色，影响结果判定。PAS 染色法可能造成切片中组织细胞的共染现象，配置染液及染色过程繁琐，且无法染色部分菌种［6-8］。因此，探索新的染色方法，对于提高真菌感染的检查效率与检出率十分必要。

图1 不同真菌感染皮下组织及阴性对照经改良荧光染色的镜下表现（×400） 1A～1C：分别为孢子丝菌感染、念珠菌感染、未知真菌感染，组织中清晰可见呈亮蓝色的菌丝及孢子；1D：阴性对照，无荧光反应

图2 皮下真菌病组织标本改良荧光染色（CFW）、苏木精-伊红（HE）、过碘酸-雪夫（PAS）和六铵银（GMS）染色的镜下表现（×400） 孢子丝菌感染皮下组织改良CFW染色，真菌成分呈阳性，而HE、PAS、GMS染色均呈阴性。菌种未明确的某一真菌感染组织CFW染色，孢子染成亮蓝色，与黑暗背景对比明显；HE染色孢子呈淡黄色，PAS染色孢子呈紫红色，GMS染色孢子呈棕黑色。着色芽生菌感染的皮下组织CFW染色可见孢子呈黑色轮廓，HE染色可见厚壁着色孢子，PAS染色孢子呈紫红色，GMS染色孢子呈棕黑色

CFW 是一种二苯乙烯类化合物，能够非特异性地结合真菌细胞壁的多种成分，如几丁质和纤维素的β 葡聚糖等。在355 nm 紫外光激发下，经CFW 染色的真菌会迅速发出亮蓝色荧光，而其他组织成分呈暗淡的灰蓝色。CFW染色法早已成为国外实验室检测真菌的常用方法，其对培养真菌的染色能力最早于1962年被报道［9］，随后在石蜡切片和冰冻切片中的应用也得到证实［4］。国外多个研究证明［3，10-11］，CFW 荧光染色法对卡氏肺孢子虫囊肿、头癣和白念珠菌感染具有很高的敏感性和特异性。目前国内CFW荧光染色法在真菌病诊断上的应用尚处于起步阶段，研究也较为局限。杨通等［12］在21 例深部真菌病（包括鼻咽、食管、胃窦、肺部、膀胱）的组织病理检测中，对比GMS 和PAS 染色法，CFW 荧光染色法的符合率达100%，且操作更简单易行。罗云鹏等［13］在浅部真菌病的诊断研究中指出，特敏增强荧光染色的检出率显著高于KOH 湿片法，也高于CFW 荧光染色。而在皮下真菌病的组织病理诊断上，国内尚无相关研究的报道。

我们应用改良CFW荧光染色法检测21例皮下真菌病患者组织中的真菌成分，以HE、PAS和GMS染色法为对照，发现改良CFW 荧光染色法阳性率高于传统的HE、PAS 染色法。虽然改良CFW 荧光染色法与GMS 染色法在统计学上无显著性差异，但改良CFW荧光染色法步骤简单，操作简便，有更高的实用性。CFW 荧光染色法在紫外激发光下，镜下菌丝及孢子呈亮蓝色，背景黑暗，与其他染色方法相比较，真菌的形态特征清晰、明显。在着色芽生菌等暗色真菌的检出上，由于其硬壳小体结构致密，其成分主要是葡聚糖，几丁质含量少，而CFW荧光染色剂主要结合的是真菌胞壁中的几丁质，在荧光显微镜下几乎不能观察到亮蓝色荧光。这个结果同 Harrington与 Hageage［4］的研究结果一致。

本实验取材来源于我科1987—2017年30年间收集的皮下真菌病标本，部分组织病理取材年限较久远，蜡块保存欠佳，实验中需多次取材方可得到较为完整的病理组织，由于病理切片层次、部位不同，可能导致实验存在假阴性。受组织固定液不同批次等影响，染色效果可能受到一定影响；且科室尚不具备菌种小培养条件，部分组织大培养阳性，但无法进一步准确确定菌种。本研究21例皮下真菌病患者中，CFW染色法阳性率最高，检出14例阳性，7例阴性。假阴性结果可能来自于多次重复切片导致组织真菌成分遗失；实验操作步骤不够熟练，对各个过程时间把握欠佳；组织学读片经验有限等。过度读片，将皮肤组织中的弹力纤维、胶原纤维、染色过程中混入的棉物纤维等与真菌成分相混淆等可能造成假阳性结果。本实验病理取材例数相对较少，尚需要进行大数据研究，为临床应用提供更多的参考。

综上，改良Calcofluor White荧光染色法是一种准确、实用的真菌组织病理学诊断方法，虽前期投入相对较高，但其应用不仅限于诊断，更可以拓展到真菌病的治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突