干扰素γ和TRAIL联合对HaCaT细胞程序性坏死的影响及机制研究

寿艳红 张臻 骆肖群 陈圣安 李峰 朱小华 林尽染 秦海红 杜鹃 陈荪奕 杨永生 徐金华

复旦大学附属华山医院皮肤科，上海 200040

程序性坏死是一种可调控的胱天蛋白酶（caspase）非依赖性细胞程序性死亡方式，细胞呈坏死样结构特点［1］。以往研究证实，肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的程序性坏死可发生在小鼠成纤维细胞L929、人组织淋巴瘤细胞U937 和Fas 相关死亡域蛋白缺陷型人白血病T 细胞系Jurkat 细胞中［2-4］，干扰素γ（IFN-γ）和TNF 相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）可分别诱导巨噬细胞和小鼠胚胎成纤维细胞程序性坏死［2，5］。较为公认的机制是受体相互作用蛋白1（receptor interaction protein kinase 1，RIP1）/RIP3/混合系激酶区域样蛋白（mixed lineage kinase domainlike protein，MLKL）通路传递死亡信号，活性氧参与死亡执行［6-7］。关于角质形成细胞（keratinocyte，KC）的程序性坏死研究较少，主要集中于中毒性表皮坏死松解症（TEN）和Stevens-Johnson 综合征（SJS）的发病机制研究［8-9］。TEN/SJS 是以 KC 广泛性坏死为特征的疾病，Saito等［9］用电镜发现TEN患者中KC 发生的坏死是程序性坏死，小鼠实验中通过抑制程序性坏死可以完全阻断TEN 样病变也证明了这一点。此外，以往研究证实，IFN-γ 在TEN患者疱液和外周血中浓度升高［7，10］。de Araujo等［11］还发现，疱液中TRAIL浓度有明显升高。由此我们推测，IFN-γ 和 TRAIL 是 SJS/TEN 发病中重要的细胞因子，因此我们探索应用IFN-γ 和TRAIL 诱导KC 程序性坏死，探讨程序性坏死在TEN/SJS 发病机制及治疗中的作用。

材料与方法

一、细胞、试剂和仪器

HaCaT 细胞来自美国ATCC 细胞库；高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶产自美国Gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒产自美国BD 公司；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒产自日本TaKaRa公司；RIP3、MLKL 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔抗人RIP1、RIP3、MLKL和磷酸化 RIP1（pRIP1）、RIP3（pRIP3）、MLKL（pMLKL）抗体产自美国 CST 公司；IFN-γ、TRAIL 产自美国PeproTech 公司。活性氧检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG产自上海碧云天生物技术公司。

二、细胞培养

将HaCaT细胞接种于含1%青链霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于各项实验。

三、噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖

取对数生长期HaCaT 细胞按1×104/孔接种于96孔板，在37 ℃及5%CO2环境中培养24 h，去上清液，分别加入12.5、25、50、100 μg/L IFN-γ或1、2、4、8 μg/L TRAIL，或同时加入不同浓度的 IFN-γ 和TRAIL，对照组不加IFN-γ和TRAIL，空白孔不加细胞，只加培养基，每种处理设5 个复孔，培养48 h后，每孔加入10 μl MTT溶液，在37 ℃、5%C02环境中孵育4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜溶液110 μl，置摇床上充分振荡10 min，在酶标仪490 nm波长下测量各孔吸光度（A值）。细胞存活率=［各处理组平均A490 值-空白组平均A490 值）/（对照组平均A490 值-空白组平均A490 值）］×100%。预实验发现，50、100 μg/L IFN-γ或4、8 μg/L TRAIL均可抑制细胞生长，但 50 μg/L IFN-γ 和 4 μg/L TRAIL 及更高浓度IFN-γ、TRAIL 同时作用可显著抑制细胞存活，因此选择 50 μg/L IFN-γ、4 μg/L TRAIL 进行后续实验。此外，为了确定caspase 抑制剂zVAD（美国Pepro Tech 公司）作用时间及浓度，分别加入10、20、40、60、80 μmo/L zVAD 预处理0.5、1、1.5 h，再加入 50 μg/L IFN-γ 和 4 μg/L TRAIL 处理48 h 后检测各孔A值，发现 ≥ 40 μmo/L zVAD 预处理 1、1.5 h 均可显著抑制细胞存活，因此选择40 μmo/L zVAD预处理1 h作为实验条件。

四、实验分组

取对数生长期HaCaT 细胞按1 × 106/孔接种于6 孔板，预培养24 h；去上清液，阴性对照组不加IFN-γ 或TRAIL，处理组分别加入50 μg/L IFN-γ（IFN-γ 组）、4 μg/L TRAIL（TRAIL 组）、50 μg/L IFN-γ +4 μg/L TRAIL（细胞因子联合组）或40 μmol/L zVAD预处理1 h后同时加入50 μg/L IFN-γ及4 μg/L TRAIL（zVAD 联合组），作用48 h，光镜下观察细胞形态后用于以下实验。

五、流式细胞仪检测细胞坏死

收集细胞，用含有乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶溶液消化，移至流式检测管，PBS洗涤2次，1×结合缓冲液洗涤1次，重悬细胞，加入5 μl膜联蛋白V混匀后，加入5 μl碘化丙锭，混匀，室温下避光孵育15 min；每管加入400 μ1结合缓冲液，混匀，流式细胞仪检测细胞坏死率。

六、qPCR检测RIP3、MLKL mRNA相对表达量

收集细胞提取RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA，进行定量PCR。应用Primer5.0设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RIP3 正向引物 5′-TGTACAAGTCTAGAGCTAGCAT GTCGTGCGTCAAGTTA-3′，反向引物5′-CGCGGCC GCGGATCCTTATTTCCCGCTATGATT-3′；MLKL：正向引物5′-GGATTGCCCTGAGTTGTTGC-3′，反向引物 5′-AACCGCAGACAGTCTCTCCA-3′；GADPH 正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR 反应体系20 μl，分别为绿色荧光染料 SYBR 10 μl，正反向引物各 0.04 μl，参比染料 ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 7.52 μl，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。反应结束后，确认各个基因的阈值循环数（Ct），利用GAPDH 校正。△△Ct =（实验组 Ct目的基因-Ct管家基因）-（阴性对照组Ct目的基因- Ct管家基因），计算RIP3、MLKL基因的相对表达水平（2-△△Ct）。

七、Western印迹检测RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL、caspase 8蛋白水平

收集阴性对照组、IFN-γ组、TRAIL组、细胞因子联合组细胞，向HaCaT 细胞中加入裂解液，冰上裂解5 min 后，将细胞刮下做超声处理，4 ℃12 000×g离心15 min，吸取上清液分装并保存。用BCA法测定蛋白浓度，以20 μg 蛋白样品上样，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚偏氟乙烯（PVDF）转膜，5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1 h，加入兔抗人RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL 蛋白抗体，4 ℃孵育过夜后，加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG室温孵育1 h，ECL发光法检测反应条带。以GAPDH 为内参，用ImageJ 软件分析条带灰度。

另取zVAD 联合组、阴性对照组、细胞因子联合组细胞重复上述步骤，检测各组上述各蛋白表达水平。

八、免疫荧光染色观察pRIP3、pMLKL 在细胞中的表达分布

HaCaT细胞爬片，预培养24 h后，去上清液，分为阴性对照组、IFN-γ组、TRAIL组和细胞因子联合组，处理同以上实验分组，作用48 h 后，4%多聚甲醛固定15 min，0.2%Triton X-100破膜15 min，5%牛血清白蛋白封闭30 min，加兔抗人pRIP3（1∶500）、兔抗人 pMLKL（1∶500）一抗，4 ℃孵育过夜；加Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG（1∶200）、Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG（1∶200）避光室温下孵育1 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-imidino-2-henylndoleDAPI）染核5 min，每步骤间均PBS漂洗3次，50%甘油封片，荧光显微镜下观察。

九、以2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）为荧光探针检测HaCaT细胞内活性氧

用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol/L。将HaCaT细胞接种在24孔板中预培养24 h 后，去上清液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min。用无血清培养液洗涤细胞3 次，将细胞分为阴性对照组、IFN-γ 组、TRAIL组和细胞因子联合组，处理方法同以上实验分组，刺激1.5 h，收集细胞用流式细胞仪检测活性氧水平。

十、统计分析

用SPSS 22 进行统计学分析。实验重复3 次，数据均以±s表示，不同组间观察指标的比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同处理对HaCaT细胞形态的影响

光镜下观察发现，阴性对照组HaCaT细胞形态无变化，细胞生长密集，呈上皮样贴壁生长。不同细胞因子作用48 h 后，细胞形态均发生变化。IFN-γ组、TRAIL 组细胞数减少；细胞因子联合组、zVAD联合组细胞数减少，出现坏死样形态特征，如细胞膜破裂、细胞器肿胀、核皱缩等。

二、不同处理对HaCaT细胞存活率的影响

作用48 h后，阴性对照组HaCaT细胞存活率为100%，但 IFN-γ 组、TRAIL 组、细胞因子联合组、zVAD 联合组分别为 73.16% ± 5.71%、81.46% ±4.68%、72.18%±2.93%、69.67%±3.24%，单因素方差分析显示，差异有统计学意义，F= 24.34，P＜0.001。两两多重比较显示，IFN-γ 组、细胞因子联合组、zVAD 联合组HaCaT 细胞存活率显著低于阴性对照组，差异均有统计学意义（t值分别为26.83、27.82、30.32，均P＜ 0.05），细胞因子联合组与zVAD联合组间差异无统计学意义，t=2.51，P＞0.05。

三、不同处理对HaCaT细胞坏死的影响

IFN-γ组、TRAIL组、细胞因子联合组、zVAD联合组HaCaT 细胞坏死率分别为6.42% ± 1.36%、6.35% ± 1.91%、9.86% ± 1.31%、10.33% ± 2.16% ，阴性对照组为5.26%±0.91%，5组间差异有统计学意义，F=6.17，P＜ 0.01（图1）。细胞因子联合组、zVAD 联合组均显著高于阴性对照组，t值分别为4.61、5.07，均P＜ 0.05，细胞因子联合组与zVAD 联合组间差异无统计学意义（t=0.47，P＞ 0.05）。

四、不同处理对HaCaT 细胞RIP3、MLKL mRNA表达的影响

图2 IFN-γ、TRAIL、zVAD 单独或联合作用 48 h 后 HaCaT 细胞RIP3、MLKL mRNA 表达情况 n=3。a：与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。IFN-γ：干扰素γ；TRAIL：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；zVAD：胱天蛋白酶抑制剂；RIP3：受体相互作用蛋白3；MLKL：混合系激酶区域样蛋白

图3 干扰素γ、TRAIL 单独或联合作用48 h 后HaCaT 细胞RIP1、pRIP1、RIP3、pRIP3、MLKL、pMLKL 蛋白表达情况 TRAIL：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；RIP：受体相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶区域样蛋白

作用 HaCaT 细胞 48 h 后，IFN-γ 组、TRAIL 组、细胞因子联合组、zVAD 联合组及阴性对照组间RIP3、MLKL mRNA水平差异均有统计学意义（F值分别为9.16、28.49，均P＜ 0.05，图2）。两两多重比较显示，细胞因子联合组、zVAD 联合组RIP3 mRNA 水平明显高于阴性对照组（t值分别为0.99、1.84），MLKL mRNA亦高于阴性对照组（t值分别为1.51、2.17），均P＜ 0.05，细胞因子联合组与zVAD联合组间RIP3、MLKL mRNA水平差异无统计学意义（t值分别为0.84、0.65，均P＞ 0.05）。

五、不同处理对HaCaT细胞程序性坏死相关蛋白等表达的影响

作用 48 h 后，IFN-γ 组、TRAIL 组 RIP1、RIP3、MLKL 蛋白表达水平与阴性对照组相比无明显变化，但细胞因子联合组RIP1、RIP3、MLKL、pRIP1、pRIP3、pMLKL 蛋白表达水平高于阴性对照组（图3，表1，均P＜ 0.05）。zVAD 联合组与细胞因子联合组相比，caspase 8 表达降低，RIP1、RIP3、MLKL、pRIP1、pRIP3、pMLKL 蛋白表达水平升高（图4，表2，均P＜ 0.05）。

图4 干扰素γ与TRAIL联合及共同与zVAD联合对HaCaT细胞pRIP1、RIP1、胱天蛋白酶8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL 蛋白表达的影响 TRAIL：TNF 相关凋亡诱导配体；zVAD：胱天蛋白酶抑制剂；RIP：受体相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶区域样蛋白

表1 干扰素γ、TRAIL单独或联合作用对HaCaT细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表达的影响（±s）

表1 干扰素γ、TRAIL单独或联合作用对HaCaT细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白及其磷酸化蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。与阴性对照组（不用干扰素γ、TRAIL或zVAD处理）比较，a P ＜ 0.01，b P ＜ 0.05。TRAIL：TNF相关凋亡诱导配体；RIP：受体相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶区域样蛋白

组别阴性对照组干扰素γ组TRAIL组细胞因子联合组F值P值pRIP1 1 1.387±0.040 1.878±0.033a 2.144±0.494a 8.819 0.006 RIP1 1 1.929±0.263 1.996±0.298 2.790±0.560a 21.158＜0.001 pRIP3 1 2.017±0.291b 1.659±0.032 4.344±0.802a 34.867＜0.001 RIP3 1.025±0.043 1.318±0.224 1.510±0.341b 4.272 0.045 pMLKL 1 2.032±0.075 3.683±0.974a 4.494±0.489a 9.432 0.005 MLKL 1 1.247±0.073 1.319±0.228 1.452±0.139a 5.605 0.023

六、pRIP3、pMLKL在细胞中的表达及分布

1.pRIP3 在细胞中的表达及分布：HaCaT 细胞经细胞因子联合作用48 h 后细胞质可见强绿色点状或团块状绿色荧光斑点，IFN-γ组、TRAIL组作用48 h后细胞质可见浅绿色荧光斑点，阴性对照组细胞未见明显的绿色荧光斑点，见图5。

2.pMLKL 在细胞中的表达及分布：经细胞因子联合作用48 h后，HaCaT细胞膜可见明显红色荧光斑点，IFN-γ组、TRAIL组细胞膜仅见浅红色荧光斑点，阴性对照组细胞未见明显荧光斑点，见图6。

七、不同处理对HaCaT细胞活性氧产生的影响

作用 48 h 后，IFN-γ 组、TRAIL 组、细胞因子联合组活性氧平均荧光强度分别为494.33 ± 63.59、434.67 ± 16.57、901.33 ± 64.49，阴 性 对 照 组 为199.01±4.04，4组间差异有统计学意义，F=26.81，P＜0.001。细胞因子联合组与阴性对照组比较，差异有统计学意义，t=702.00，P＜ 0.05。

讨 论

本研究显示，IFN-γ 和 TRAIL 共同作用可导致细胞存活率明显下降、坏死率升高，说明IFN-γ 和TRAIL 可诱导细胞坏死。zVAD 为caspase 抑制剂，当其预处理HaCaT细胞 1 h 后 ，联合 IFN-γ 和TRAIL（zVAD 联合组）可致细胞存活率进一步下降、坏死率进一步升高，但细胞存活率、坏死率在细胞因子联合组与zVAD 联合组之间差异均无统计学意义，提示IFN-γ和TRAIL诱导的细胞死亡类型与zVAD 联合组诱导的类似。光镜下观察发现，细胞因子联合组和zVAD 联合组均出现坏死样形态特征。提示 IFN-γ 和 TRAIL 联合对 HaCaT 细胞程序性坏死具有一定影响。

表2 干扰素γ与TRAIL联合及共同与zVAD联合对HaCaT细胞pRIP1、RIP1、caspase 8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL蛋白表达的影响（±s）

表2 干扰素γ与TRAIL联合及共同与zVAD联合对HaCaT细胞pRIP1、RIP1、caspase 8、pRIP3、RIP3、pMLKL、MLKL蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。与细胞因子联合组（干扰素γ+TRAIL）比较，a P ＜0.01，b P ＜0.05。TRAIL：TNF相关凋亡诱导配体；zVAD：胱天蛋白酶抑制剂；RIP：受体相互作用蛋白；MLKL：混合系激酶区域样蛋白

组别阴性对照组细胞因子联合组zVAD联合组F值P值pRIP1 1a 1.723±0.048 1.874±0.121b 116.175＜0.001 RIP1 1 0.991±0.109 1.241±0.067a 10.998 0.010胱天蛋白酶8 1a 2.056±0.190 1.007±0.057a 84.271＜0.001 pRIP3 1b 2.792±0.456 7.226±1.175a 58.25＜0.001 RIP3 1 1.144±0.145 1.842±0.341a 13.305 0.006 pMLKL 1a 1.644±0.041 2.111±0.143a 127.111＜0.001 MLKL 1 0.970±0.135 1.335±0.098a 13.319 0.006

图5 pRIP3 免疫荧光检测（×400） 绿色荧光斑点表示pRIP3蛋白，阴性对照组未见明显绿色荧光斑点，干扰素γ组、TRAIL组细胞质可见浅绿色荧光斑点，细胞因子联合组细胞质可见强绿色荧光斑点。pRIP3：磷酸化受体相互作用蛋白3 图6 pMLKL 免疫荧光检测（×400） 红色荧光斑点表示pMLKL蛋白。阴性对照组细胞无明显荧光斑点，干扰素γ组、TRAIL组细胞膜可见浅红色荧光斑点，细胞因子联合组细胞膜可见明显红色荧光斑点。pMLKL：磷酸化混合系激酶区域样蛋白

在程序性坏死中，RIP1 可能通过自身磷酸化实现对 N 端激酶的调控［11-12］，激活 RIP3，构成“RIP1-RIP3 坏死体”，同时在刺激因子作用下，RIP3 也发生自磷酸化，激活下游MLKL 使其磷酸化［3］，pMLKL 通过自身寡聚化后逐渐转移至膜上［13-14］，可能通过对细胞膜的渗透、破坏，导致细胞死亡。本研究显示，在阴性对照组、IFN-γ 组、TRAIL组之间 ，RIP3、MLKL基因表达及 RIP1、RIP3、MLKL 蛋白表达无明显差异，细胞因子联合组RIP3、MLKL 基因表达和RIP1、RIP3、MLKL 蛋白及其磷酸化蛋白表达均较阴性对照组明显升高，证实 IFN-γ 和 TRAIL 联合作用下 RIP1/RIP3/MLKL 信号通路被激活。zVAD 联合组中，经过zVAD 预处理，caspase 8 表达降低，RIP1、RIP3、MLKL 及其磷酸化蛋白表达较细胞因子联合组进一步上升，其程序性坏死程度进一步加深。考虑到IFN-γ和TRAIL也可以参与炎症反应、细胞凋亡等［6］，推测当caspase 8 被抑制时，IFN-γ 和 TRAIL 更易诱导程序性坏死发生。通过荧光显微镜可见，pMLKL 主要分布在细胞膜上，说明pMLKL 可能是HaCaT 细胞程序性坏死的执行者，通过对细胞膜完整性的破坏导致细胞死亡。既往研究发现，在人组织淋巴瘤细胞U937 和Fas 相关死亡域蛋白缺陷型人白血病T细胞系Jurkat 中，活性氧在MLKL 活化的上游和下游都起作用，一方面，活性氧促进“RIP1-RIP3 坏死体”稳定，并在程序性坏死过程中启动正反馈扩增循环［15］，此外，活性氧可以特异性氧化 RIP1 上 3 个关键半胱氨酸［4］，从而促进S161自磷酸化和坏死体形成；另一方面，过度产生的活性氧可以损伤脂类、蛋白、DNA 等，影响 Ca2+浓度，引起细胞坏死［4，16］。本研究显示，IFN-γ 和TRAIL 联合作用可导致大量活性氧产生，说明在HaCaT 细胞程序性坏死中，活性氧也可能起重要作用，但这些仍需进一步研究。

本研究中，IFN-γ 单独作用后细胞存活率明显下降，但坏死率无明显变化，其原因可能是IFN-γ单独作用可诱导HaCaT 细胞发生凋亡［7］，而与TRAIL联合作用时促程序性坏死作用明显，考虑可能是IFN-γ 和TRAIL 细胞因子间相互作用所致。研究发现，药物特异性CD8+T 细胞可产生IFN-γ，募集单核细胞/巨噬细胞和树突细胞，进一步促进其他促炎细胞因子如 TRAIL 等表达［10，17］。此外，IFN-γ 可通过上调 KC 死亡受体 4、5 的表达，使 KC结合更多的TRAIL［11］，该机制可能也参与程序性坏死过程。还有研究发现，IFN-γ 可以打破细胞对TRAIL的耐受，增强细胞对TRAIL的敏感性［18］。

我们通过形态学分析以及细胞存活率、坏死率和程序性坏死相关基因和蛋白表达的检测，证实IFN-γ 和 TRAIL 联合可诱导 HaCaT 细胞发生程序性坏死，同时伴随着活性氧产生，这些将有助于进一步理解SJS/TEN 中发生的KC 程序性坏死机制，以IFN-γ、TRAIL作为靶点的治疗也许可减少KC大量坏死，缓解病情。鉴于SJS/TEN发病机制的复杂性，SJS/TEN中KC发生的程序性坏死是否有TNF-α等其他细胞因子参与以及RIP1/RIP3/MLKL通路与活性氧的具体作用等还需要深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突