荧光染色法和KOH湿片法检测浅部真菌感染的效果比较

余菁 许辉 刘芝翠 马越娥 史玉玲

同济大学附属第十人民医院皮肤科，上海 200072

在常规的真菌直接镜检中，最常用的浮载液是10%～20%KOH，但因其背景杂乱，菌丝及孢子与脂滴、气泡、杂质等不易分辨，当菌量较少或只有少量孢子时，容易漏诊。荧光染色法用于真菌检测时，染料能与真菌细胞壁的纤维素和几丁质特异性结合而使菌体着色，真菌（菌丝和孢子）在镜下为清晰的亮蓝色，而组织呈淡蓝色，背景为暗色，菌丝的横隔结构和孢子的出芽形态清晰可见，易于识别。本研究收集600 例临床拟诊为浅部真菌感染、102例拟诊为马拉色菌感染的病例，通过对比荧光染色法和KOH 湿片法检出阳性率和阅片时间，验证荧光染色法诊断浅部真菌感染的优越性。

材料与方法

1.标本来源：2017年7月至2018年2月期间到同济大学附属第十人民医院皮肤科就诊、临床拟诊为真菌感染的浅部真菌病患者600例，其中拟诊为手癣 47 例，足癣 146 例，体股癣 212 例，甲真菌病187 例。另收集拟诊为马拉色菌感染患者102 例，包括花斑糠疹54 例，马拉色菌毛囊炎48 例。见表1。

2.试剂与仪器：荧光染色液（包含荧光素、KOH、复染剂，江苏莱芙时代生物科技公司）；10%KOH 溶液自配；奥林巴斯CX21 显微镜（增加荧光模块，日本奥林巴斯公司）；沙氏培养基（海科马嘉微生物技术有限公司）。

表1 600例拟诊手足癣、体股癣、甲真菌病及102例拟诊马拉色菌感染患者标本真菌检测阳性率比较［阳性例数（%）］

3.标本采集：①毛发标本采集：选择8 例病损处、毛囊口折断的毛发，用镊子将毛发从头皮拔出，尽量保留毛根部；②皮屑标本采集：钝刀片刮取皮损炎性活动性边缘的鳞屑；③甲标本采集：钝刀从甲变色、萎缩或变脆的部位、健甲与病甲的交界处取材，保证一定深度，最好能达到甲板腹侧；④毛囊炎标本采集：用无菌钝刀的尖端挑破脓疱顶端，向内挤压取出毛囊内乳酪状内容物，将标本置于载玻片上。

4.直接镜检及培养：将同一患者同一部位取得的标本随机分为3份，其中2份分别用KOH湿片法和荧光染色法由同一检测员进行直接镜检，以高倍镜下观察到菌丝或孢子判定为阳性，开始观察时计时，记录阅片时间（镜检阴性不计时）。将另1份标本接种在沙堡弱培养基25 ℃培养2周，根据形态学及生化反应鉴定有无真菌生长及菌种（马拉色菌标本不进行培养）。

5.荧光染色法与KOH 湿片法检测：对600 例拟诊为浅部真菌感染标本及按其来源（皮屑、甲、毛发），分别比较其检出阳性率及平均阅片时间。对拟诊为马拉色菌感染的54 例花斑糠疹标本，48 例马拉色菌毛囊炎标本分别比较两种方法检出阳性率及平均阅片时间。以培养为金标准比较两种方法的漏诊情况。

6.统计学分析：采用SPSS 20.0统计软件，对于计数资料，理论数≥5 且总样本量≥40 时采用卡方检验；1 ≤理论数＜5且总样本量≥40时采用连续性校正的卡方检验；理论数＜1或总样本量＜40时采用Fisher精确检验。计量资料采用±s表示，两样本均数比较采用配对设计t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.镜下表现：荧光染色后，真菌（菌丝和孢子）被荧光标记，在镜下可见亮蓝色真菌轮廓（图1）。而KOH 湿片法镜下背景杂乱，菌丝及孢子呈无色透明或淡绿色折光，与背景反差小，与脂滴、气泡、杂质等不易分辨，马拉色菌毛囊炎标本还可见大量脂滴与孢子混杂，不易辨别（图1）。

2.两种方法检测浅部真菌的阳性率：600 份标本中，荧光染色法与KOH 湿片法检出阳性分别为546份（91.00%）、489份（81.50%），阳性率差异有统计学意义（χ2= 22.83，P＜ 0.05）。其中，皮屑标本405份，荧光染色法和KOH湿片法检出阳性数分别为380份（93.83%）、348份（85.93%），阳性率差异有统计学意义（χ2= 13.89，P＜ 0.05）；甲标本187 份，检出阳性数分别为 159 份（85.03%）、136 份（72.73%），差异有统计学意义（χ2= 8.49，P＜0.05）。毛发标本8份，分别检出7份和5份阳性，差异无统计学意义（P=0.57）。

图1 浅部真菌感染患者标本荧光染色法和KOH 湿片法检测的效果比较 荧光染色后，真菌菌丝和孢子被荧光标记，见亮蓝色真菌轮廓。而KOH湿片法镜下背景杂乱，菌丝及孢子呈无色透明或淡绿色折光，与背景反差小，与脂滴、气泡、杂质等不易分辨；马拉色菌毛囊炎标本还可见大量脂滴与孢子混杂

3.两种方法检测皮屑来源标本的阳性率比较：405例皮屑标本，主要来源于临床拟诊为手足癣和体股癣患者。手癣47 例，荧光染色法和KOH 湿片法阳性率分别为87.23%、70.21%，差异有统计学意义（P＜0.05）。足癣146例，阳性率分别为92.47%、82.19%，差异有统计学意义（P＜0.05）。体股癣212例，阳性率分别为96.23%、91.98%，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表1。

4.两种方法检测甲来源标本的阳性率比较：荧光染色法和KOH湿片法检测甲标本187例，远端侧位甲下型69 例，阳性率分别为86.96%、71.01%（P＜ 0.05）；近端甲下型 24 例，阳性率分别为58.33%、50.00%（P＞ 0.05），全甲毁损型51例，检出阳性率分别为88.24%、70.59%（P＜ 0.05）；白色浅表型 43 例，阳性率分别为 93.02%、90.70%（P＞0.05）。见表1。

5.两种方法检测马拉色菌感染标本的阳性率比较：102 例拟诊为马拉色菌感染患者的标本中，荧光染色法与KOH 湿片法的检测阳性率分别为92.16%、59.80%（P＜ 0.05），对花斑糠疹的检出阳性率差异无统计学意义（P＞0.05），对马拉色菌毛囊炎标本检出阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

6.两种检测方法阅片时间比较：600 份浅部真菌标本，荧光染色法与KOH 湿片法阅片时间分别为（73.67 ± 13.56）s、（87.12 ± 15.83）s（t= 14.60，P＜ 0.05）。54 份花斑糠疹标本分别为（38.36 ±8.79）s、（41.25 ± 15.67）s（t= 1.14，P＞ 0.05）。48份马拉色菌毛囊炎标本分别为（42.14 ± 12.61）s、（103.56 ± 9.48）s（t=17.83，P＜ 0.05）。

7.培养结果及两种方法漏诊的比较：在600例标本中，479 例培养阳性，手癣 37 例，足癣 114 例，体股癣198例，甲真菌病127例，毛发3例。检出菌种包括红色毛癣菌302 例、犬小孢子菌43 例、石膏样小孢子菌32例、须癣毛癣菌36例、絮状表皮癣菌13例、白念珠菌52例、断发毛癣菌1例。培养阳性的479 例中，荧光染色法阳性476 例，阴性3 例（0.63%）；KOH 湿片法阳性 465 例，阴性 14 例（2.92%），两种方法检测漏诊率差异有统计学意义（χ2=7.25，P＜ 0.05）。荧光染色法灵敏度99.37%，特异度42.15%；KOH湿片法灵敏度97.28%，特异度80.17%。见表2。

表2 600例浅部真菌感染患者培养结果及荧光染色法和KOH湿片法检测效果比较（例）

讨 论

浅部真菌病是各类感染性皮肤病中常见病和多发病。直接镜检法是浅部真菌形态学检查的基本方法［1］。KOH 湿片法是临床上直接镜检使用最早、最广的方法，该法操作简单、快捷，不需要特殊仪器。但缺点亦明显，例如背景杂乱、检出率偏低，该缺点在检测甲标本、马拉色菌毛囊炎尤为明显，且孢子类结构易与气泡、脂滴混淆。荧光染色液是一种高纯度荧光素和特定比例KOH 的复合溶液，荧光素标记的几丁质重组酶能与真菌细胞壁中的几丁质特异性结合，形成强荧光复合物，使真菌结构发出亮蓝色的荧光。该方法容易掌握，操作方法与KOH 湿片法一致，且无需加热，耗时短，结果直观，同时也弥补了KOH湿片法对疑难标本（菌量少的标本、材质厚的甲屑标本、仅有孢子的标本、外涂药膏的标本等）易出现假阴性的缺点。特别是对于马拉色菌毛囊炎标本，荧光染色法不标记脂滴，易于分辨脂滴和孢子。值得注意的是，荧光染色法也能标记植物纤维素，空气和玻片上存在的少量纤维，在荧光显微镜下也可发出荧光，但纤维形态一般不规则，大小、粗细、亮度等都与真菌有很大差异，没有典型的真菌横隔和出芽结构，凭经验一般可以避免假阳性情况的发生。［2-5］

我们通过对比荧光染色法和KOH湿片法检测门诊收集的拟诊为浅部真菌感染标本的检出阳性率，发现荧光染色法阳性率明显高于KOH湿片法，且阅片时间明显低于KOH湿片法。根据标本来源细分，皮屑、甲标本荧光染色的阳性率均高于KOH法，研究结果与既往类似报道一致［6-8］。两种方法对毛发标本的检出率差异无统计学意义，但由于毛发标本仅8例，可能会影响统计结果。

本研究皮屑标本主要来自拟诊为体股癣和手足癣的患者，两种方法对来自体股癣皮屑检出阳性率差异无统计学意义，由于体股癣患者皮屑角质较薄，杂质较少，镜下菌丝在KOH 湿片中也较易辨认。两种方法对手癣水疱鳞屑型检出阳性率差异无统计学意义，而角化增厚型检出阳性率有明显差异，对足癣角化过度型检出阳性率有明显差异。当皮屑角质较厚时，KOH不易溶解角质使之透明，组织与真菌不易分离，检出较困难，且角化型手足癣一般出现湿疹化，皮屑中菌量较少，容易遗漏，而荧光染色标本对比明显，不易漏诊。

对于甲来源标本，两种方法对远端侧位甲下型和全甲毁损型检出阳性率有明显差异，而近端甲下型和白色浅表型检出阳性率差异无统计学意义。考虑近端侧位甲下型因其病变在甲下，用钝刀刮取时不易取到病变部位甲屑，使两种方法阳性率均偏低。胡记妹等［9］发现用浸软法可提高甲标本镜检阳性率。白色浅表型因病变部位较浅，刮取的标本一般菌量较多、杂质较少，两种方法阳性率均较高。而远端侧位甲下型和全甲毁损型指（趾）甲增厚，KOH不易溶解，呈灰黄或灰褐色，杂质较多，镜下杂乱，不易分辨，而荧光染色法镜下除真菌为亮蓝色，组织细胞为淡蓝色，其他杂质均不染色，能明显提高检出阳性率。已有文献报道荧光染色法在甲真菌病检测中的应用价值［10-11］。

马拉色菌主要定植于头、面、颈、肩、胸、背等部位，是一种嗜脂性酵母菌，与多种皮肤疾病如花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎、特应性皮炎、脂溢性皮炎、银屑病等有关［12］。本研究两种方法对马拉色菌检出阳性率分别为92.16%、59.80%，高于派克墨水（84.44%）［13］和芝加哥天蓝（68.68%）［14］，但由于标本选择和操作人员不同，荧光染色和其他染色方法的对比还有待进一步研究。我们采用两种方法检测花斑糠疹标本的阳性率和阅片时间结果无显著性差异，而马拉色菌毛囊炎有显著差异。考虑主要是由于花斑糠疹患者选取典型病例，镜下呈葡萄状分布的圆形、卵圆形孢子和短粗、两头钝圆的腊肠形菌丝的典型形态特征在KOH 涂片中也清晰易辨，而只表现为孢子形态的马拉色菌毛囊炎采用KOH 法镜检时，其孢子混于角栓之中，易与散在、圆形、暗绿色、反光的脂肪滴混淆，很难准确查出阳性孢子，而用荧光染色后孢子呈亮蓝色，脂滴、气泡均不着色，对比明显，可提高马拉色菌检出的准确性和速度。Ramos 等［15］也发现荧光增白剂能提高马拉色菌镜检阳性率。

综上所述，对于浅部真菌感染的直接镜检，荧光染色法检出阳性率和阅片时间均优于KOH湿片法，特别是对于角质较厚、菌量较少、仅有孢子或杂质较多的标本，荧光染色法更快速、简便，阳性率更高，漏诊更少。

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