肌球蛋白轻链激酶在结肠癌组织及癌旁组织中的表达及其与结肠癌病理特征的关系

张梦辉 王宏刚 石运涛 周静芳 孙苏安 刘 露

(南京医科大学附属淮安第一医院1 消化科，2 病理科，江苏省淮安市 223300，电子邮箱：zhangmh0520@163.com)

结肠癌是我国常见的消化系统肿瘤之一，其预后与早期诊断和治疗密切相关。结肠镜检查及病理活检是早期诊断结肠癌最重要的方法。但不少患者在结肠镜检查发现肿瘤时，已处于中晚期，术后需要辅助化疗以提高生存率。目前已有的化疗方案有助于延长结肠癌患者生存期，但仍需寻找更为有效的靶向分子药物，以获得更好的疗效。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是依赖于钙调蛋白的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，分为肌型MLCK和非肌型MLCK，广泛存在于非肌肉性细胞及真核细胞中。MLCK的主要功能是使肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化，活化肌球蛋白重链三磷酸腺苷酶，介导骨架蛋白微丝滑动，使细胞收缩，最终形成细胞间隙[1]。肿瘤细胞间隙的形成利于肿瘤细胞侵袭和转移，并使肿瘤细胞与周围组织连接减弱、肿瘤细胞运动增强，促使肿瘤进展。有研究显示，MLCK在子宫肌瘤、卵巢癌、肝癌、乳腺癌等良恶性肿瘤中的表达相对升高[2-4]，其参与了肿瘤的发生发展，但暂无结肠癌组织中MLCK蛋白表达的研究。本研究探讨MLCK蛋白与结肠癌患者临床特征的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2013年6～12月在我院经结肠镜检查及外科手术切除后病理活检证实为结肠癌的63例患者的临床资料。纳入标准：(1)所有患者的病灶均完整切除，术后病理证实为结肠癌，切缘无残留；(2)有完整的临床资料及生存时间等随访资料；(3)所有患者均为结肠癌新发病例，术前未行放化疗等治疗。排除标准：(1)有严重脏器疾病、血液疾病、免疫系统疾病等影响手术及术后预后者；(2)术后病灶有残留者；(3)术前行放化疗者。其中男36例、女27例，年龄26～87岁，中位年龄60岁。本研究获得本院伦理委员会审查通过，所有研究对象均对本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 检测方法：每例患者术后取癌组织及癌旁组织各1份，大小0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm，石蜡包埋制成蜡块。委托西安艾丽娜生物科技有限公司在各个蜡块中分别取直径为1.5 mm、厚度为0.5 cm的圆柱形组织条，汇总为一个新的蜡块并切片，切片厚度为4 μm，制成组织芯片。采用免疫组织化学EnVision二步法检测MLCK蛋白在结肠癌组织与癌旁组织中的表达情况。步骤如下：(1)将石蜡切片置于67℃烘箱中烘片2 h脱蜡，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗3次，3 min/次。(2)取柠檬酸盐缓冲液，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的柠檬酸盐缓冲液中，中档微波处理10 min。(3)取出微波盒于流水中自然冷却，取出玻片，蒸馏水冲洗2次，再用PBS冲洗2次，5 min/次。(4)每张切片滴加0.3%过氧化氢，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，5 min/次后，每张切片滴加MLCK一抗(武汉博士德生物公司，批号：BM4290，工作浓度为1 ∶1 000)，室温下孵育2 h。(5)PBS冲洗3次，5 min/次，除去PBS，每张切片滴加聚合物增强剂，室温下孵育20 min。(6)PBS冲洗3次，5 min/次，除去PBS液，每张切片滴加EnVisionTM检测试剂(Dako公司，批号：GK500705)，室温下孵育30 min。(6)PBS冲洗3次，5 min/次后，每张切片滴加二氨基联苯胺液，苏木素复染，自来水冲洗，热水蓝化，电吹风干燥，中性树胶封固，最后置于显微镜下观察。

1.2.2 MLCK表达的判定：由2位病理医师采用双盲法观察组织芯片的染色情况，根据染色强度与阳性细胞比例综合计分。在400倍显微镜下随机观察5个视野，以细胞质内出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为MLCK阳性细胞，分别计1分、2分、3分，染色阴性计0分。按阳性细胞比例进行评分：0分(阳性细胞比例≤5%)，1分(5%<阳性细胞比例≤25%)，2分(25%<阳性细胞比例≤50%)，3分(50%<阳性细胞比例≤75%)，4分(75%<阳性细胞比例≤100%)。根据两项分数的乘积将MLCK的表达情况分为4级，分数≤4分记为-，5～8分记为+，9～12分记为++，>12分记为+++。其中-为表达阴性；+、++、+++为表达阳性。根据MLCK的表达情况，将患者分为MLCK阳性表达组和MLCK阴性表达组，分析MLCK表达情况与结肠癌临床病理特征的关系。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MLCK蛋白在结肠癌组织与癌旁组织中的表达 在63例结肠癌组织中，MLCK表达阳性52例，阳性率为82.5%，染色部位均位于胞浆；而63例癌旁组织中，MLCK表达阳性30例，阳性率为47.6%。癌旁组织中MLCK表达阳性率低于癌组织(χ2=16.092，P<0.001)。

2.2 MLCK蛋白表达情况与结肠癌患者临床病理特征的关系 MLCK表达阳性组的中位年龄为59岁，表达阴性组的中位年龄为68岁，两组年龄差异无统计学意义(Z=-1.884，P=0.060)。两组的性别、肿瘤发生的部位、肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移情况及浸润肠壁全层情况比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 MLCK表达与结肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

3 讨 论

在肿瘤细胞中，多种信号通路共同参与MLCK的活化，其中大多通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)1/2、P38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)途径，以及炎症相关路径参与细胞的增殖、凋亡过程。尤嘉琮[5]发现，ERK磷酸化可促进乳腺癌细胞增殖和迁移，信号转导途径与ERK1/2-MLCK-p-MLC、ERK1/2-Survivin和ERK1/2-β-连环蛋白-细胞周期蛋白D1密切相关，P38/MLCK参与抗肿瘤细胞的凋亡。左莉[6]将MLCK抑制剂ML-7作用于结肠癌细胞并构建MLCK敲除模型(siMLCK)发现，癌细胞克隆、迁移率降低，且构建ERK1敲除模型后MLCK mRNA和蛋白表达明显降低，提示ERK1/MAPK信号通路可调节MLCK的表达。炎症相关结肠癌的发病与炎症因子、氧化应激、肠道微生态及基因改变等有关[7]，炎症细胞、炎症因子与肿瘤的增殖、浸润、转移有关[8]。肿瘤坏死因子通过活化核转录因子κB来介导MLCK启动子活性增加，从而引起肠上皮功能障碍[9]。

有学者认为，MAPK信号通路调控MLCK从而改变癌细胞运动能力[10]。Barkan等[11]发现，癌细胞由休眠变为增殖状态依赖于纤连蛋白的产生和整联蛋白β的信号传导，MLCK通过与整合素β作用使MLC磷酸化和形成丝状肌动蛋白应力纤维。MLCK不仅可通过收缩骨架蛋白使细胞变形而参与细胞迁移，还可活化下游信号分子使细胞外基质降解来参与肿瘤细胞的脱落[12]。马小艳等[3]用MLCK siRNA的病毒载体感染人卵巢癌细胞株构建出MLCK表达下调模型，发现癌细胞的迁移能力明显下降，进一步检测发现核转录因子κB的亚单位p65及其下游分子金属基质蛋白酶2表达降低，提示MLCK可通过活化核转录因子κB及金属基质蛋白酶2表达来调节肿瘤迁移。然而，Lee等[13]发现，在结肠癌组织中MLCK mRNA表达量较正常组织减少；谭翔等[14]的研究显示MLCK mRNA及MLC蛋白9在非小细胞肺癌中的表达明显降低，但在淋巴结转移患者中明显升高。研究表明，肌球蛋白轻链激酶假基因在肺癌及结肠癌组织高表达，其可导致mRNA不稳定并抑制其表达，从而促进肿瘤细胞的增殖和迁移[15]，但目前肌球蛋白轻链激酶假基因对MLCK蛋白表达的影响尚不清楚，暂未检索到MLCK蛋白在结肠癌组织中的表达情况的研究。本研究结果显示MLCK蛋白在结肠癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。提示MLCK基因与肿瘤的迁移有关，但本研究发现MLCK蛋白表达与结肠癌患者的淋巴结转移无相关性，且与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、肿瘤大小、浸润肠壁全层情况、肿瘤病理分级均无相关性(均P>0.05)，这提示MLCK蛋白参与结肠癌发生发展的具体机制仍不明确。但研究显示MLCK蛋白可调控结肠上皮细胞的连接紧密性，从而影响肠黏膜的通透性，因此其对肠道炎症、肿瘤、菌群平衡均有重要影响[16]。

综上所述，MLCK蛋白在结肠癌组织和癌旁组织中存在差异表达，但具体分子机制不明，仍有待进一步开展结肠癌细胞的分子生物学实验加以阐明。本课题组拟增加结肠癌样本量，并纳入溃疡性结肠炎患者进行分析，建立随访数据库，研究MLCK蛋白在肠道炎症与炎症相关结肠癌发病中的作用，探索小分子靶向药物MLCK抑制剂ML-7对结肠炎症和肿瘤的防治作用。