RNA干扰黏着斑激酶表达对宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移能力、细胞凋亡及Caspase-3相对表达量的影响▲

刘宁宁 冯 蓓 段 伟 李红霞

(延安大学附属医院1 肿瘤科，2 妇科，陕西省延安市 716000，电子邮箱：283132024@qq.com)

宫颈癌的死亡率在妇科肿瘤中居第二位，发病率约占所有妇科肿瘤的10%[1]。由于宫颈癌发病早期的临床表现不典型，因此，患者就诊时已多为晚期，导致死亡率一直居高不下[2-3]。研究表明，宫颈癌是多基因共同作用失衡的结果，而随着肿瘤分子生物学研究的发展，人们对肿瘤发生与发展分子机制的认识不断加深，为肿瘤的分子靶向治疗提供了一个全新的方向和目标[4-5]。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一种非受体胞浆酪氨酸激酶，在调节细胞生存、凋亡、黏附、侵袭、迁移等方面发挥重要作用[6-7]。FAK在乳腺癌、宫颈癌、直肠癌、甲状腺癌等恶性肿瘤中呈高表达状态，并且与肿瘤的转移和侵袭密切相关[8-9]。FAK下游信号通路有FAK-丝裂原活化蛋白激酶通路、FAK-信号转导与转录激活子通路、FAK-磷脂酰肌醇3激酶通路，介导细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学特性的改变[10]。RNA干扰是一种正常生物体内抑制特定基因表达的现象，可特异性下调特定基因的表达，在恶性肿瘤、遗传性疾病中广泛应用[11]。构建带有抗性基因的小干扰核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)质粒载体，可使目的基因整合入肿瘤细胞染色体中，从而获得稳定表达细胞株，有利于RNA干扰某一基因对细胞生物学的影响[12]。本文探讨RNA干扰FAK表达对宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移能力、细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)相对表达量的影响，为宫颈癌的基因治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料 宫颈癌HeLa细胞株由我院中心实验室提供，逆转录病毒载体pSuper-Retro由我院病理生理医学部惠赠，β-肌动蛋白抗体(批号：20189592，1 ∶1 000)及辣根过氧化物酶(hoseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔二抗(批号：20148462，1 ∶10 000)均购自上海生工公司，抗Caspase-3抗体(批号：20191233，1 ∶1 000)、抗FAK抗体(批号：20164344，1 ∶1 000)均购自北京博奥森生物技术有限公司，杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)购自美国Gibco公司。

1.2 RNA干扰FAK表达体系的建立 根据GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的FAK基因序列，按siRNA的序列设计siRNA引物，正义链序列：5′-GATCCGCCACCTGGGCCAGTATTATTTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGG-3′，反义链序列：3′-GCGGTGGACCCGGTCATAATAAAGTTCTGCTATTATAGCCGGTCCACC-3′，引物由上海生工公司合成。

1.3 细胞培养与转染 用含10%小牛血清的DMEM在37℃、5% CO2培养箱中培养HeLa细胞株，培养到对数生长期后将其制备为单细胞悬液，将细胞种植于6孔板中培养，每孔接种1×105个，取8 μL脂质体LipofectamineTM2000加入250 μL无血清DMEM培养基中，并置于一消毒的EP管，混匀后室温孵育10 min；其中观察组取4 μg RNA干扰FAK表达质粒进行转染，阴性对照组采用同样方法转染空白载体质粒；同时选择不进行任何处理的HeLa细胞株作为空白对照组，只用含血清的DMEM培养基传代培养。

1.4 细胞增殖活性检测 采用四甲基偶氮唑盐法检测细胞的增殖活性。3组细胞培养48 h后制备出细胞悬液，按照每孔细胞数1×105个进行接种，加入96孔板中培养。培养2 d后每孔加入四甲基偶氮唑盐溶液20 μL，继续培养4 h。弃孔内培养液，添加二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶充分溶解，用酶标仪(美国Sigma公司，型号：2892型)检测490 nm波长处的吸光度值(A)，计算细胞增殖活性，细胞增殖活性=[(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)]×100%。

1.5 细胞侵袭检测 将基质胶铺于Transwell侵袭小室聚碳酯微孔膜的上表面，37℃放置30 min。各组取1×105个培养48 h后的细胞分别加入Transwell上室中，在下室中加入600 μL含10%小牛血清的DMEM培养基，甲醛固定微孔膜下层细胞并采用苏木精-伊红染色4 h，在400倍光学显微镜下任意选取5个视野，对每个视野中的微孔细胞数进行计数，计算细胞侵袭穿透指数。细胞侵袭穿透指数=微孔侵袭穿透细胞数/微孔总细胞数。

1.6 细胞凋亡检测 将3组培养48 h的细胞接种于6孔板中，每孔15×104个细胞，低温离心收集细胞，使用磷酸缓冲盐溶液洗涤两遍，添加300 μL结合缓冲液悬浮细胞；添加5 μL的膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素混匀，在室温下避光孵育15 min；上机前5 min再加入5 μL碘化丙啶染色，上机即刻再加200 μL结合缓冲液，置于流式细胞仪(美国BD公司，型号：8714型)分析。每个样品随机计数4个视野，计算凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。

1.7 蛋白表达检测 将3组培养48 h的细胞5 mL，3 000 r/min离心10 min，取下层细胞，裂解细胞后12 000 r/min离心，取上清，沸水浴变性5 min，取50 μg蛋白上样，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳实现分离，对蛋白进行点转移，转到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗(抗Caspase-3抗体、抗FAK抗体，1 ∶1 000) 4℃培养过夜，TBST缓冲液洗膜，二抗(1 ∶10 000)室温培养1 h，TBST缓冲液洗膜，采用增强型电化学发光试剂盒(美国BD公司，批号：7244)进行曝光处理。以β-肌动蛋白作为内参检测Caspase-3蛋白及FAK蛋白相对表达量。上述实验均重复3次，取平均值。

1.8 统计学分析 采用SPSS 22.00软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组的细胞增殖活性、凋亡指数、侵袭穿透指数和迁移指数比较 观察组的细胞增殖活性、侵袭穿透指数和迁移指数均低于空白对照组和阴性对照组(均P<0.05)，凋亡指数大于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)，但空白对照组和阴性对照组的上述指标比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 3组的细胞增殖活性、凋亡指数、侵袭穿透指数和迁移指数比较(x±s,%)

注：与空白对照组比较，#P<0.05；与阴性对照组比较，*P<0.05。

2.2 3组细胞Caspase-3与FAK蛋白相对表达量比较 观察组的Caspase-3相对表达量高于阴性对照组与空白对照组，FAK蛋白相对表达量低于阴性对照组与空白对照组。见图1。

图1 3组的Caspase-3与FAK蛋白相对表达情况

3 讨 论

我国宫颈癌的发病人数逐年上升，且呈年轻化趋势。目前宫颈癌的治疗主要采用手术与放疗为主，化疗为辅的综合治疗，但都存在一定的缺陷，且不良反应较多[13]。研究表明，肿瘤的发生发展与细胞的增殖、凋亡、侵袭平衡有关，细胞过度增殖与侵袭、凋亡受抑制均是影响肿瘤发生发展的重要因素[14]。

FAK主要在细胞质中表达，是一个分子量为125 kD的非受体、非膜性的胞质酪氨酸蛋白激酶[15]，其在进化上高度保守，并在调节细胞生存、黏附、凋亡中发挥重要作用。RNA干扰作为一种新兴的逆向遗传研究方法，具有无毒副作用、高效、高特异性等特点[16]。本研究构建了针对FAK基因的siRNA表达载体pSuper-FAK，并成功筛选出稳定表达的细胞株来观察FAK蛋白表达量的变化，结果显示，观察组的Caspase-3相对表达量高于阴性对照组与空白对照组，FAK蛋白相对表达量低于阴性对照组与空白对照组，提示pSuper-FAK导入后能降低宫颈癌细胞FAK蛋白的表达。本研究显示，观察组的细胞增殖活性低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)，但空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示FAK具有调节宫颈癌细胞增殖的作用，FAK基因表达下调后，细胞增殖能力下降，考虑其增殖能力下调可能为细胞周期改变而引起。有研究显示肺癌细胞中的FAK活化可促进细胞分裂，下调FAK表达则抑制细胞增殖[17]，与本研究结果相似。

FAK在乳腺癌、舌癌、甲状腺癌、前列腺癌、宫颈癌、直肠癌等多种上皮及间质来源的肿瘤中高表达或过度激活[18]。失巢凋亡是指正常的上皮和内皮细胞从细胞外基质上脱离时发生的凋亡模式，整合素和FAK调控肿瘤细胞的失巢凋亡。FAK还能刺激内源性的Caspase而强有力地阻断细胞凋亡[19]。有研究表明，宫颈癌标本中FAK表达阳性率高，而宫颈细胞、宫颈炎细胞中FAK表达为阴性，FAK高表达与宫颈癌患者临床预后不良相关，特别是FAK基因可通过抑制肿瘤细胞凋亡而起到促肿瘤的作用，通过下调FAK基因表达，可以诱导肿瘤细胞凋亡[20]。本研究结果显示，观察组的细胞凋亡指数高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)，表明抑制FAK的表达能促进宫颈癌细胞凋亡。

宫颈癌是一种以肿瘤细胞的持续增生与侵袭、永不凋亡为特征的恶性肿瘤，而促进肿瘤细胞侵袭及抑制凋亡的细胞机制是目前研究的重点。肿瘤细胞的侵袭与转移是指从肿瘤细胞脱离原发部位与基底膜黏附，侵入周围组织、进入血液与淋巴循环、从循环系统中迁出等的过程[21]。具有侵袭能力的癌细胞在侵袭过程中分泌降解酶降解周围组织，可导致肿瘤细胞扩散与转移。FAK作为整合素信号中的重要节点，其高表达可以增强肿瘤细胞的迁移能力[22]。相关研究结果显示，FAK在低侵袭性宫颈癌细胞株中的表达较低，而在高侵袭性宫颈癌细胞株中的表达较高[23]。本研究结果显示，观察组的细胞侵袭穿透指数和细胞迁移指数均低于空白对照组与阴性对照组(均P<0.05)，与上述研究结果相似。

总之，RNA干扰FAK基因表达可抑制细胞增殖、侵袭及迁移能力，促进细胞凋亡和Caspase-3蛋白的表达，从而发挥抑癌作用。