赖氨酸特异性脱甲基酶2B及B细胞淋巴瘤-2蛋白、Hrk蛋白在卵巢癌组织中的表达情况及其临床意义▲

易叶叶 况 燕 蒙家华 杨慧兰 徐 红 侯海瑞

(广西医科大学第一附属医院妇产科，南宁市 530021，电子邮箱：1036240289@qq.com)

卵巢癌的病死率居女性恶性肿瘤的首位，预后不良，严重威胁着许多女性的生命健康[1-2]。由于其早期临床症状不明显或与其他良性妇科疾病症状相似，大部分卵巢癌患者出现临床症状时其肿瘤已转移到腹膜表面，就诊时已处于疾病晚期，治疗难度大,易复发,预后差。尽管目前临床上针对卵巢癌的治疗方法不断改进,患者的总生存期仍然很差，5年生存率无明显改善[3]。因此,探索卵巢癌的发病机制,开发新的肿瘤诊断标志物，有利于卵巢癌的早期诊断和治疗。本研究采用免疫组化法分析组蛋白去甲基化酶—赖氨酸特异性脱甲基酶2B[lysine(K)-specific demethylase 2B,KDM2B]、凋亡抑制基因蛋白B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)，以及促进凋亡基因蛋白-Hrk蛋白在卵巢癌中的表达情况，并其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年12月至2018年9月在我院进行诊治的100例卵巢疾病患者的卵巢组织标本，包括20例正常卵巢组织(来源于子宫肌瘤或子宫腺肌病并行全子宫双附件切除术的患者)，30例良性卵巢肿瘤(13例浆液性囊腺瘤和17例黏液性囊腺瘤)，42例上皮性卵巢癌(25例浆液性腺癌、10例黏液腺癌、6例子宫内膜样癌和1例鳞状细胞癌)，8例非上皮性卵巢癌(5例未成熟畸胎瘤、2例肉瘤及1例卵黄囊瘤)。所有病例在取材前均未接受放、化疗及免疫治疗，且均经组织病理学检查确诊。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 兔抗人KDM2B多克隆抗体(批号：ab85807)购自CST公司，兔抗人Bcl-2蛋白单克隆抗体购自博士德公司(批号：A00040-1)，兔抗人Hrk蛋白多克隆抗体(批号：ab45419)购自Abcam公司；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)试剂盒(批号：PV-6001)和二氨基联苯胺显色试剂盒(批号：ZLI-9018)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法 应用免疫组化SP法检测不同卵巢组织中KDM2B、Bcl-2蛋白、Hrk蛋白的表达情况,具体实验步骤严格按照试剂说明书进行，其中KDM2B、Bcl-2蛋白、Hrk蛋白抗体工作液浓度分别为1 ∶500、1 ∶100、1 ∶50,以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照,以已知阳性切片作为阳性对照。最后在显微镜下观察结果。

1.4 结果判定标准 采用Volm双评分法[4]进行结果判定，阳性定义为在胞核或胞质内出现棕黄褐色颗粒，其着色强度明显高于背景非特异性染色。从400倍高倍镜下，每张切片均随机取5个视野,每个视野根据阳性细胞比例和染色强度计分。阳性细胞的百分比计分：<25%为1分，25%～<50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。染色程度计分:不着色计0分,淡黄色计1分,棕黄色计2分,棕褐色计3分。把两者分数相乘作为最终判定结果:0分为阴性(-),1～2分为弱阳性(+),3～4分为中度阳性(++),≥5分为强阳性(+++)。其中(+)、(++)、(+++)均为阳性表达。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman相关系数进行相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同卵巢组织中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白的阳性表达情况 恶性卵巢肿瘤的KDM2B、Bcl-2蛋白阳性表达率明显高于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织(均P<0.05),恶性卵巢肿瘤组织、良性卵巢肿瘤组织、正常卵巢组织的Hrk蛋白阳性表达率依次升高(均P<0.05)，见表1及图1。

表1 不同卵巢组织中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白阳性表达情况比较[n(%)]

注：与正常卵巢组织比较，*P<0.05；与良性卵巢肿瘤组织比较，#P<0.05。

图1 不同卵巢组织中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白表达情况(SP法，×400)

注：1A、1B、1C分别为正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织、恶性卵巢肿瘤组织中KDM2B的表达；2A、2B、2C分别为正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织、恶性卵巢肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达；3A、3B、3C分别为正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织、恶性卵巢肿瘤组织中Hrk蛋白的表达。

2.2 KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白表达情况与恶性卵巢组织临床病理学特征的关系 低分化、国际妇产科联合会(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移病例的KDM2B及Bcl-2蛋白阳性表达率均分别高于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移病例(均P<0.05)，而Hrk蛋白阳性表达率均分别低于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移病例(均P<0.05)。不同年龄段病例的3种蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2～4。

表2 KDM2B表达情况与恶性卵巢肿瘤患者临床病理学特征的关系

表3 Bcl-2蛋白表达与恶性卵巢肿瘤患者临床病理学特征的关系

表4 Hrk蛋白表达与卵巢癌肿瘤患者临床病理学特征的关系

2.3 恶性卵巢肿瘤组织中KDM2B、Bcl-2蛋白表达与Hrk蛋白表达的相关性 在恶性卵巢癌肿瘤组织中，KDM2B、Bcl-2蛋白的阳性表达率均与Hrk蛋白的阳性表达率呈负相关(rs=-0.581,P=0.023；rs=-0.341,P=0.008)。

3 讨 论

组蛋白去甲基化酶KDM2B也称为NDY1、JHDM1B或FBXL10，属于JHDM家族。由KDM2B基因编码的蛋白质包含含有Jumonji C结构域、富含半胱氨酸结构域、植物同源结构域，富含脯氨酸的区域和富含亮氨酸的重复序列。其中，Jumonji C结构域是催化H3K36me2和H3K4me3去甲基化的活性中心，并且可以通过其含锌指结构的半胱氨酸区域与CpG岛结合[5-6]。KDM2B在调节细胞生长、增殖、衰老、凋亡、核糖体RNA表达及造血干细胞自我更新等多方面发挥重要作用[7-8]；其在多种恶性肿瘤中表达异常,被认为是一种致癌基因[9-11]。Zhao等[9]发现KDM2B在胃癌细胞中高表达,敲低KDM2B表达能抑制胃癌细胞生长和增殖；Tzatsos等[10]发现KDM2B在胰腺导管腺癌中高表达，且其表达水平与肿瘤分级及转移有关，沉默KDM2B能消除胰腺导管腺癌细胞的致瘤性。以上结果均提示KDM2B可能参与多种肿瘤的发生发展过程。本研究结果显示，恶性卵巢肿瘤组织的KDM2B阳性表达率明显高于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织(均P<0.05)，且低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移的恶性卵巢肿瘤病例的KDM2B阳性表达率均分别高于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移病例(均P<0.05)，这与Kuang等[11]的研究结果相似。这提示KDM2B也可能与卵巢癌的发生发展有关。

Bcl-2蛋白是调节细胞凋亡的Bcl-2蛋白家族的创始成员，Bcl-2蛋白家族可以分为两大类:Bcl-2蛋白类,是抑制凋亡因子；Bcl-2蛋白相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)类,是促进凋亡因子[12-13]。目前，已有研究表明Bcl-2蛋白基因的损伤导致了多种恶性肿瘤的发生，包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌等[14-16]。有学者发现，Bcl-2蛋白在鳞状细胞癌组织中呈高表达，其阳性表达率与肿瘤组织学分化程度、TNM分期、浸润深度及淋巴结转移密切相关[17]。有研究证实，miR-16通过下调Bcl-2蛋白的表达,抑制细胞活性和迁移能力,诱导胃癌细胞凋亡[18]。本研究结果显示，Bcl-2蛋白在恶性卵巢肿瘤组织中的阳性表达率高于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织(P<0.05),且Bcl-2蛋白的表达阳性率随着恶性卵巢肿瘤组织分级及FIGO分期的增加而升高(P<0.05)，存在淋巴结转移者Bcl-2蛋白的阳性表达率增高(P<0.05)。这提示Bcl-2蛋白与卵巢癌的发生有一定的关系。

Hrk蛋白属于凋亡相关蛋白BH3亚家族成员。有研究表明，BH3亚家族成员均可促进细胞凋亡，起到肿瘤抑制因子的作用，Hrk蛋白通过BH3结构域与Bcl-2蛋白或Bcl-xL结合，形成异二聚体活化Bax，最终诱导细胞凋亡[19-20]。有学者报道，Hrk蛋白在乳腺癌中低表达，其表达水平与乳腺癌高病理分级和低临床分期有关，七失神同源物1可通过上调Hrk蛋白表达来促进乳腺癌细胞凋亡,在乳腺癌形成中发挥重要作用[20]。研究表明，Hrk蛋白表达上调能促进前列腺癌和卵巢癌细胞凋亡[21-22]。另有研究显示，Hrk蛋白在胃癌组织中表达水平低于癌旁组织，可能参与调控胃癌的发生发展[23]。本研究结果显示，Hrk蛋白在恶性卵巢肿瘤组织中的阳性表达率低于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织(P<0.05),且Hrk蛋白阳性表达率随着恶性卵巢肿瘤组织分级及FIGO分期的增加而降低(P<0.05)，存在淋巴结转移者Hrk蛋白的阳性表达率较低(P<0.05)。提示Hrk蛋白表达下调可能在卵巢发生发展的过程中发挥一定作用。

Wang等[24]对多形性成胶质细胞瘤进行研究后发现，沉默KDM2B的表达后Hrk蛋白的表达增加，这初步说明 KDM2B能调控Hrk蛋白的表达。而本研究结果也显示，在恶性卵巢肿瘤组织中KDM2B与Hrk蛋白的阳性表达率呈负相关(P<0.05)。而Hrk蛋白是三甲基化组蛋白H3赖氨酸27的直接靶基因,其在肿瘤中的低表达与其本身DNA甲基化有关，此外KDM2B能促进组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化[23，25-26]。由此，我们推测KDM2B可能通过促进H3K27三甲基化进而调节Hrk蛋白的表达，从而在肿瘤发生发展中起重要作用。Hrk蛋白直接作用的分子主要有Bcl-2蛋白家族和Bcl-xL。Hrk蛋白通过BH3结构域与Bcl-2蛋白或Bcl-xL结合诱导细胞凋亡，是一种促凋亡蛋白[19-20]。有研究显示Bcl-2蛋白与Hrk蛋白蛋白在胃癌组织中的表达呈负相关，Bcl-2蛋白抗凋亡基因作用受到Hrk蛋白促凋亡蛋白影响，二者之间有相互促进作用[23]。本研究结果也显示，在恶性卵巢肿瘤组织中Bcl-2蛋白与Hrk蛋白的阳性表达率呈负相关(P<0.05)。因此，我们推测Bcl-2蛋白与Hrk蛋白共同参与了卵巢癌的发生、发展。

综上所述,卵巢癌中KDM2B与Bcl-2蛋白的表达上调，Hrk蛋白的表达下调，三者可能通过不同的方式参与卵巢癌的发生发展。这可能成为卵巢癌转归及判断预后的参考指标，为临床的靶向治疗提供新思路。