结缕草高效再生体系的建立

赵俊侠，陈 耕，夏桂先，胡晓丽，潘转霞，许爱玲，皇甫张龙，张换样，李朋波

（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2.中国科学院微生物研究所，北京100080）

随我国城市绿化进程的不断加快，城镇的花园化和草坪事业有了很大发展。结缕草是禾本科结缕草属植物，属多年生草本，是暖季型草种，极耐践踏，具有抗病、无虫害等优点。用结缕草密植可构筑成人工草地，组成园林绿化地，供人们观赏、游憩或作为运动场地。草坪具有调节湿度和温度、降低空气污染、减少城市噪音、防止水土流失等功能。但草坪业在发展中存在两大问题：一是草坪越冬困难，青绿期较短，枯黄期长；二是草坪养护需要大量的淡水。也就是说，解决草坪草抗冻性及抗旱性问题为草坪业发展的关键。目前，最行之有效的方法就是尽快选育具有抗冻及抗旱特性的草坪草新品种。因此，培育耐寒、耐旱、绿色期长的结缕草新品种具有重要意义。随生物技术的发展，利用转基因技术（将抗冻、抗旱基因导入草坪草，可获得优质的草坪草种质资源）培育优质抗逆的草坪草新品种具有一定的优势。要获得结缕草的转基因再生植株，先必须通过植物细胞的组织培养建立起结缕草的再生体系。

本试验对草坪草结缕草的细胞培养及植株再生进行了研究，旨在利用现代生物技术，建立高效的植株再生体系，为下一步利用转基因技术改造结缕草，建立草坪草的遗传转化体系、获得转基因植株、培育转基因草坪草奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 结缕草草种由中国科学院微生物研究所提供。种子经过70%酒精浸泡2 min，再放入0.1%HgCl2中消毒15～20 min，然后用无菌水冲洗5～6 次，用吸管吸出草籽，将其置于有培养基的培养皿中，封口，28 ℃培养20 d 后可获得愈伤组织。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 诱导培养基 根据前期棉花和水稻在组织培养中的不同特性和试验结果[1]，诱导培养基是获得愈伤组织及植株再生的关键，本试验诱导培养基选择NB 改良培养基和MS 改良培养基。其中，NB改良培养基：N6培养基的大量元素＋B5培养基的微量元素＋B5培养基的有机成分＋蔗糖30 g/L＋水解酪蛋白500 g/L，pH 值5.8。MS 改良培养基：MS培养基的大量元素＋MS 培养基的微量元素＋MS有机成分＋蔗糖30 g/L，pH 值5.8。愈伤组织诱导时每种培养基中分别添加2，4 mg/L 的2，4-D。

1.1.2.2 分化培养基 分化培养基以MS 培养基为主，并在部分培养基中添加水解酪蛋白，观察添加生物蛋白提取物对胚性愈伤组织的形成是否有促进作用。分化培养基为：MS 培养基＋KT 0.1 mg/L；MS 培养基＋KT 0.1 mg/L＋水解酪蛋白500 g/L。

1.1.2.3 生根培养基 生根培养基为MS 培养基＋IAA 0.2 mg/L＋NAA 0.1 mg/L。

1.2 试验方法

将消毒处理过的结缕草种子接种到含有不同激素组合的MS 和NB 培养基上，分别进行光培养和暗培养，进行愈伤组织诱导。光培养是将材料置于日光灯照射下培养，光照强度2 000 lx，培养温度28 ℃；暗培养是将材料置于暗箱中培养，直到愈伤组织分化，产生幼苗为止，培养温度28 ℃。经过30～40 d 培养，种子上可见小的愈伤组织突起，7 d后将其小心剥下，便可得到块状愈伤组织；经2～3 代继代培养，从扩增后的愈伤组织中挑选表面光滑、乳白色、呈颗粒状的部分，转移到分化培养基上；21 d 后，愈伤组织表面可见一层细的白色绒毛生成，产生胚性愈伤组织；然后再经过8～10 d 的培养开始分化，呈现许多绿色斑点，继而发育形成小突起，之后会见到点状生长点和微细的根出现；培养7 d 后转入生根培养基，经过20 d 培养，可获得完整的再生植株。

2 结果与分析

2.1 不同培养基添加不同浓度激素对愈伤组织诱导的影响

对结缕草种子进行愈伤组织的诱导，可得到不同的愈伤组织出愈率（表1）。由表1 可知，MS＋2 mg/L 2，4-D 培养基处理215 粒种子，得到58 块愈伤组织，出愈率为27%；MS＋4 mg/L 2，4-D 培养基处理210 粒种子，得到46 块愈伤组织，出愈率为22%；NB＋2 mg/L 2，4-D 培养基处理180 粒种子，得到56 块愈伤组织，出愈率为31%；NB＋4 mg/L 2，4-D培养基处理208 粒种子，得到47 块愈伤组织，出愈率为23%。结果表明，在结缕草的愈伤组织诱导中，MS 和NB 培养基在相同诱导条件下，即相同激素浓度下，愈伤组织诱导率差别不大。而在同一培养基中，不同激素组合间，愈伤组织诱导存在一定差别[2]，2 mg/L 2，4-D 组合优于4 mg/L 2，4-D 组合。表明在愈伤组织的形成和发育中，2 mg/L是2，4-D 较为合适的添加浓度。这与张树录[3]对禾本科植物组织培养、王景雪等[4]对玉米胚叶再生植株的研究结果一致。

表1 结缕草的愈伤组织出愈率

2.2 胚性愈伤组织的产生

在结缕草愈伤组织的诱导阶段，MS 培养基和NB 培养基在相同诱导条件下，愈伤组织的诱导率差别不大；但在其愈伤组织的分化阶段，即胚性愈伤形成时，MS 培养基却远远优于NB 培养基。在MS 培养基上进行分化时，愈伤组织有60%～70%能产生胚性愈伤并得到再生植株；而在NB 培养基上进行分化时，愈伤组织全部变成绿色的硬块状，并伴随许多毛状根生成，最终却不能得到再生植株。MS 培养基非常适合结缕草愈伤组织分化，并形成胚性愈伤，最终生成再生植株，NB 培养基基本不能使结缕草愈伤组织分化。参考多种植物不同的组织培养试验可知，与其他培养基相比，MS 培养基显著特点是硝酸盐、钾和铵含量高，其硝酸钾和磷酸二氢钾的终浓度分别为1 900，170 mg/L，是目前普遍使用的培养基。它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不至于影响离子间的平衡。MS 固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要，具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长。而NB 培养基基本成分中硝酸钾和磷酸二氢钾的含量较MS 培养基有大幅度提高，其终浓度分别为2 830，400 mg/L。研究表明，二者对胚的诱导在不同植物上有不同表现，MS 培养基上表现好的有大豆胚[5]、早熟苹果胚、矮红花幼胚、荔枝胚、甘薯[6]、棉花胚状体[7]等；NB 培养基上表现好的有水稻[8]、大麦胚[9]等。

试验结果表明，在添加水解酪蛋白的培养基上，结缕草的分化均明显好于不添加水解酪蛋白的培养基。添加某些植物提取有机物，有助于植物愈伤组织的分化，形成胚性愈伤。KENT 等[10]报道，添加牛奶番茄汁能促进大麦未成熟胚的生长；GONZALEZ 等[11]研究认为，加入10%椰子汁有利于洋葱胚的拯救；PRZYWARA 等[12]在培养三叶草杂合胚胚珠时，在培养基中添加15%黄瓜汁效果很好；李宝平等[13]研究表明，在培养基中添加20 mL/L 椰子乳有利于芫荽胚的生长。原因可能有2 个，一是由于这些提取物中含有一些能促进植物细胞分化生长的微量因子，对植物胚形成和发育具有明显的促进作用；二是对培养物供应足够的氨基酸态氮是诱导胚状体发生的重要条件。

2.3 不同光照条件对愈伤组织分化和植株再生的影响

在结缕草愈伤组织的诱导阶段，光培养和暗培养条件下愈伤组织的诱导率差别不大。但在其分化阶段，暗培养条件下，愈伤组织通过分化成胚性愈伤组织[14-17]，经体细胞发生途径产生再生植株的数量大大高于光培养条件下愈伤组织的分化。由表2可知，暗培养条件下，愈伤组织的分化率为55%，植株再生率为47%；光培养条件下，愈伤组织的分化为10%，植株再生率为7%。光对于某些植物胚胎的生长具有很大影响，主要表现在光能抑制未成熟胚的早期萌发。从表2 还可看出，光培养条件下，12 块分化的愈伤组织得到9 株再生植株，再生率为75%；暗培养条件下，68 块分化的愈伤组织得到58 株再生植株，再生率为85%。说明在结缕草的培养中，分化后胚性愈伤组织的植株再生率是相当高的。对于结缕草的组织培养及植株再生体系的建立，暗培养模式优于光培养模式。

表2 不同光照条件对愈伤组织分化的影响

3 结论

植物体外再生技术，包括器官发生和体胚发生，是生物技术研究的前提。建立高效的结缕草高效再生体系，是利用基因工程将外源基因导入其植株，获得具抗逆性状的再生植株的重要基础。结缕草和草坪草，用原生质体进行转化，其过程比较繁琐复杂，农杆菌介导法以转化方法简便、成本较低等特点在草种的基因转化中应用较为广泛。本试验通过对MS 培养基和NB 培养基稍加改进，使结缕草愈伤组织的诱导率达到27%；在分化培养基中添加酪蛋白水解物，在暗培养条件下，愈伤组织的分化率达到55%，植株再生率达到47%，建立了一套完整的植株再生体系，为下一步将耐旱、抗冻等外源基因导入结缕草，获得优质的草坪草种质资源奠定了基础。