OSCC组织中的Pinx1、CD44v6蛋白的表达及其意义

李宏 ，王新娟 ，武宝峰 ，梁仁杰 ，郭福君

(1.河南科技大学第一附属医院开元院区口腔颌面外科，河南 洛阳471000；2.河南科技大学第一附属医院开元院区生物实验室，河南 洛阳471000)

近年来，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）的发病率具有上升的趋势，临床上OSCC的发生能够导致患者生存预后的恶化[1]。流行病学研究认为，OSCC的发病率可超过262～637/10万人左右[2]。

生物学蛋白分子的改变，能够影响肿瘤细胞早期的浸润能力，增加癌细胞的增殖调控平衡的改变。PIN2码/TRF1相互作用蛋白（Pinx1）的表达，能够抑制端粒酶的活，降低癌细胞的增殖风险，抑制癌细胞 DNA的扩增[3]；CD44拼接变异体 6（CD44v6）蛋白的表达浓度的上升，能够促进癌细胞浸润能力的改变，导致癌细胞的粘附能力及血管内皮细胞的浸润风险的增加[4]。部分研究揭示了CD44v6在OSCC及胃癌等肿瘤中的高表达情况，认为CD44v6的表达与恶性肿瘤患者的临床转归密切相关，但对于Pinx1的分析研究不足。为了揭示OSCC患者的发病机制，从而为临床上OSCC患者的早期诊断及免疫靶向治疗提供参考，本次研究选取我院2014年6月-2016年12月收集的68例OSSC组织 （OSCC组），探讨了CD44v6蛋白、Pinx1蛋白的表达情况，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2014年6月-2016年12月收集的68例OSCC组织（OSCC组）、正常口腔黏膜组织34例（对照组）。

OSCC 组，年龄 42～76 岁，平均 58.9±9.5岁，男性41例、女27例，TNM分期：Ⅰ期患者14例、Ⅱ期患者24例、Ⅲ期患者23例、Ⅳ期患者7例；分化程度：其中高分化患者23例、中分化患者20例、低分化患者25例；发生淋巴结转移33例。对照组，年龄 37～77岁，平均 57.6±14.2岁，男性 22例、女12例。OSCC组与对照组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：⑴符合口腔鳞状细胞癌诊断标准[3]；⑵患者年龄范围19～79岁；⑶在我院接受口腔鳞癌根治性手术，收集患者的术后标本；⑷患者手术前为接受放化疗、免疫治疗。

排除标准：⑴未经病理学证实；⑵伴有其他部位恶性肿瘤或转移性肿瘤；⑶资料缺失导致无法进行统计分析。

1.2 免疫组化染色方法 采用石蜡切片脱蜡至水，采用离子水进行反复洗涤，加入牛奶液体封闭抗体，封闭时间为5min，加入CD44v6蛋白、Pinx1蛋白抗体（鼠来源，ABCUM 公司），37℃孵育2h，采用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加荧光染色标记的二抗抗体（购自abcum公司），37℃孵育30min，加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，采用南京凯基生物制剂公司生产的显色剂进行显色，封片，镜下观察。

1.3 免疫组化染色结果判断标准 免疫组化结果判定：CD44v6蛋白定位在细胞质及细胞膜，Pinx1蛋白定位在细胞核，阳性染色均为黄色、棕黄色、褐色，⑴根据着色强度：无色（评为0分）、淡黄色（评为1分）、棕黄色（评为2分）、褐色及黑色（评为3分）；⑵依据阳性染色的细胞数目：阳性染色细胞数目占比≤10%（评为1分）、阳性染色细胞数目占比范围11%～50%（评为2分）、阳性染色细胞数目占比51%～75%（评为3分）、阳性染色细胞数目占比＞75%（评为4分），染色强度积分与染色细胞数目积分的乘积＜3 分（-）、≥3 分（+）。

2 结果

2.1 两组标本中的CD44v6蛋白、Pinx1蛋白阳性表达率比较 OSCC组标本中的CD44v6蛋白、Pinx1蛋白阳性表达率分别为66.18%、61.76与对照组的8.82%、94.12%比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；见表 1、图 1。

表1 两组标本中的CD44v6蛋白、Pinx1蛋白阳性表达率比较[n（%）]

图1 Pinx1蛋白免疫组化染色（×400）

图2 CD44v6蛋白免疫组化染色（×400）

2.2 两组标本中的CD44v6蛋白表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移的关系 CD44v6蛋白阳性表达中低分化患者占比、发生淋巴结转移患者占比均高于CD44v6蛋白阴性表达的OSCC患者（P＜0.05）；见表 2。

2.3 两组标本中的Pinx1蛋白表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移的关系 Pinx1蛋白阳性表达的低分化患者占比、Ⅲ期+Ⅳ期患者占比、发生淋巴结转移患者占比均低于Pinx1蛋白阴性表达的 OSCC 患者（P＜0.05）；见表 3。

3 讨论

环境因素、遗传因素、饮食习惯等，均能够影响OSCC的发生，促进OSCC临床病理特征的进展[5]。作为口腔耳鼻咽喉常见的恶性肿瘤，OSCC的无瘤生存时间不足38个月，保守手术在内的相关综合性治疗措施治疗后的3年内病死率仍然超过35%[6，7]。另外一方面，现阶段临床上缺乏对于OS-CC早期诊断的有效生物学血清分子，而本次研究对于肿瘤相关蛋白的表达阳性率的研究，可以为揭示OSCC的发生机制提供参考，并能够为OSCC的免疫靶向治疗提供基础，为OSCC的早期高危人群的血清学筛查提供依据。

表2 两组标本中的CD44v6蛋白表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移的关系[n（%）]

表3 两组标本中的Pinx1蛋白表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移的关系[n（%）]

生物学因子的浓度波动，能够在促进肿瘤细胞的早期核异型性的发生，或者中晚期临床病理特征进展过程中发挥重要的作用。其能够调控癌细胞的生物学特性，干预癌细胞的扩散和转移速率等，进而影响患者的整体生存预后。Pinx1蛋白的表达，作为保护性的肿瘤相关蛋白，其能够抑制染色体末端端粒结构，抑制端粒酶的活性，降低端粒酶激活导致的染色体及DNA的过度复制[8]。基础领域的相关研究也认为，Pinx1的表达浓度的下降能够诱导肿瘤的早期发生及中晚期临床病理特征的进展[9]；CD44v6蛋白是CD44的突变体，其能够与上皮细胞膜表面配体结合，激活细胞内的肿瘤相关信号通路，增强癌细胞的过度增殖效应。同时CD44v6蛋白能够促进癌细胞的伪足的形成，提高癌细胞的变形和转移的风险。

本次研究发现在OSCC病灶组织中CD44v6蛋白的表达阳性率显著的上升，而Pinx1蛋白的表达阳性率显著的下降，提示了CD44v6蛋白、Pinx1蛋白均能够参与到OSCC肿瘤的发生过程中，通过荟萃国内外相关文献，笔者认为CD44v6蛋白、Pinx1蛋白主要通过下列几个方面的因素影响OSCC 的发生发展[10，11]：⑴CD44v6 蛋白的高表达，能够促进癌细胞的伪足的形成，提高癌细胞对于淋巴结的粘附，增强癌细胞淋巴结转移的风险；⑵Pinx1蛋白的表达的缺失，导致癌细胞的端粒结构稳定性的下降，影响到癌细胞的增殖平衡保护过程，导致癌细胞DNA扩增、染色体分离等过程显著的增强。徐清等[12]研究者也认为，OSCC病灶组织中的CD44V6的表达阳性率可平均上升27%以上，在OSCC患者短期内病灶进展速度较快、病死率较高的患者中，CD44v6蛋白的表达强度上升更为明显。在探讨相关临床病理特征的过程中，在发生了淋巴结转移及低分化的OSCC组织中，CD44v6蛋白的表达阳性率可显著的上升，提示CD44v6蛋白与OSCC患者的临床病理特征密切相关，这主要由于CD44v6蛋白能够影响到癌细胞的分化成熟能力，导致分化诱导成熟因子的表达浓度下降，同时CD44v6蛋白还能够促进癌细胞经过淋巴结跳跃式浸润的风险[13]。同样Pinx1蛋白的表达与OSCC的临床病理特征密切相关，Pinx1蛋白的表达与OSCC患者的癌细胞分化程度、肿瘤TNM分期、癌细胞淋巴结转移等病理过程密切相关，这主要由于Pinx1蛋白能够影响到癌细胞对于临近正常上皮组织的浸润能力，导致肿瘤的临床TNM分期等病理特征的进展。但部分研究者并未发现Pinx1蛋白的表达与OSCC患者的癌细胞分化程度的关系，这主要考虑与免疫组化指标的检查灵敏度的差别或者OSCC的细胞来源类型的差别有关[14，15]。

综上所述，CD44v6蛋白在OSCC组织中的表达阳性率明显的上升，而Pinx1蛋白的表达阳性率明显的下降，并且与肿瘤的病理学特征具有一定的相关性。