补精益视片对SD大鼠慢性高眼压模型初级视皮质PI3K/Akt 通路磷酸化FoxO1和IKK2表达的影响

袁铭悦 李翔 刘红佶 李祥玉

青光眼(glaucoma)是以特异性视神经(optic nerve，ON)损伤和视功能损害为特征的一类眼病，为全球仅次于白内障、可导致视力丧失的主要原因[1]。青光眼视功能损害的病因、病机复杂，迄今尚未明确。病理性眼压(intraocular pressure，IOP)升高是青光眼视功能损害的基本因素，但并不是唯一因素，即使药物和手术有效控制眼压，其视功能损害仍在缓慢进展。近年许多学者提出青光眼是一种中枢神经退行性病变[2]，其病变涉及了包括视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)、视神经、视交叉、视束、外侧膝状体(lateral geniculate nucleus，LGN)、视放射、视皮质(visual cortex，VC)整个视路。Qing G等[3]利用核磁共振检查原发性开角型青光眼患者发现中心视野未受损时相对应的VC区的神经元已出现了对视觉刺激的反应下降，表明青光眼患者视皮质神经元损伤可能早于目前常用视野计能检测到的视野改变，由此推断青光眼患者视皮质的改变可能不仅是RGCs及视神经的损伤的继发改变，还有可能主动参与了青光眼的发病。目前中医药对青光眼初级视皮质改变干预的相关研究并不多。

本实验采用烙闭上巩膜静脉法[4]诱导产生眼压维持稳定、持续时间较长的慢性高眼压(elevated intraocular pressure，EIOP)模型，选用补精益视片作为干预药物，通过测量SD大鼠眼压(intraocular pressure，IOP)，初级视皮质(primary visual cortex，PVC)磷酸化FoxO1、IKK2含量等客观指标，观察补精益视片对大鼠慢性EIOP模型PVC损害的干预，探讨SD大鼠慢性EIOP模型视功能损害的中枢机制和补精益视片的干预及作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 由成都达硕实验动物有限公司(生产许可证号：SCXK(川)2015-030)提供的清洁级SD大鼠(生产批号：20170915)30只，雌雄各半，8～12周龄，体重约160～200g。饲养条件：空气流通，相对湿度55%～75%，室温20～25℃，12小时光照维持，昼夜循环，自由摄食饮水。纳入标准：①外眼无异常；②双眼瞳孔直间接对光反射无异常；③无歪颈。

1.1.2药品及试剂 补精益视片(成都中医药大学附属医院提供，组成：枸杞子、菟丝子、楮实子、五味子、丹参、三七、车前子、茺蔚子、木瓜、青皮)批号：20170328。FoxO1(phospho-Ser319)抗体、IKK2抗体均由美国BeacomBio提供，批号分别为：BIO95906、BIO87319。

1.2 方法

1.2.1分组与给药方法

购回动物后，适应性喂养3天，进行IOP测量，正常IOP区间估计，取平均IOP在9～18mmHg者，以SPSS 20.0统计软件产生随机数字，分为3组，对照组，模型组和给药组进行单眼(右眼)造模。

对照组和模型组每天予3ml生理盐水灌胃，给药组以成人剂量20倍换算，每天予1.8g/kg体重的补精益视片混悬液3ml灌胃，每周称体重1次，根据大鼠体重变化调整给药量。造模后3天开始，每日同一时间段(16:00～17:00)给药，连续8周。

1.2.2造模方法

模型组和给药组在眼科显微镜下烙闭右眼上巩膜静脉法[4]进行造模。对照组暴露上巩膜经脉行假烙闭处理。方法如下：大鼠称重后，3%戊巴比妥钠按1.2ml/kg体重行左下腹腔注射，0.5%盐酸丙美卡因滴眼液滴术眼；消毒；于10点至2点钟位距角巩膜缘1～2mm剪开上方球结膜，分离筋膜；角巩膜缘后3～4mm近赤道部10点、12点和1点处可以发现支上巩膜静脉，以眼科手术止血器烙闭，整复球结膜，涂金霉素眼膏，待大鼠苏醒后放回笼内。0.25%氯霉素眼液滴眼，2次/日，连续用药1周。对照组眼科手术止血器不开开关而不起烙闭作用，其余操作相同。左眼不做处理。

1.2.3取材方法

大鼠灌胃8周后，大脑灌注固定法(参陈浩宇等[5]，结合本实验加以改良)： 3%戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉大鼠，仰卧暴露腹部，固定四肢，剑突下剪开胸腔，暴露心脏，夹闭腹主动脉和下腔静脉，将套有16号灌胃针针头的注射器经左心室插入升主动脉，同时剪开右心耳，快速推注含肝素钠注射液(20u/ml)生理盐水50 ml冲洗，以无血液流出为度，换4%多聚甲醛溶液50～80 ml灌注固定，先快后慢，约10～15 min推完固定液，灌注结束后，开颅取出脑组织，固定液固定72h。

1.3 检测指标及方法

1.3.1眼压测量

TNON-PEN XL眼压计每天同一时间段(14:00～16:00)测量IOP。术前3天连续测量，取平均值为正常IOP；术后即刻、1w、2 w、4w、6w、8w各测1次各组大鼠右眼IOP。

1.3.2免疫组化检测PVC中磷酸化FoxO1、IKK2

脑组织固定72h后，参照《大鼠脑立体定位图谱(第三版)》[6]切取视皮质区脑组织，标本逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做4μm连续切片，烘干备用。分别行FoxO1(phospho-Ser319)及IKK2抗体染色，检测PVC磷酸化FoxO1、IKK2含量。光学显微镜下采用免疫组化染色后PVC组织内细颗粒状、细丝状黄色至棕黄色。每组测定6只大鼠，每只测定1张PVC切片(每张取5个视野)，用 Mias-2000型图形图像分析仪测量PVC部位的p-FoxO1、IKK2阳性染色总面积(单位：S/μm2)、积分光密度及平均光密度。求取每张切片5个视野的染色面积总和、积分光密度总和及平均光密度。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 补精益视片对SD大鼠慢性EIOP模型IOP的影响见表1

经检验，各组IOP均为正态分布，且方差齐。造模前各组间差异无统计学意义(P>0.05)，各组间均衡可比。造模后即刻，对照组IOP较造模前略升高，但与造模前相比，差异无统计学意义(P>0.05)；模型组、给药组眼压升高明显，与造模前及对照组造模后即刻IOP相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。造模后8周，模型组与给药组IOP与造模前相比，差异有统计学意义(P<0.05)；与造模后即刻相比，模型组差异无统计学意义(P>0.05)；给药组差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠组间及造模、用药前后IOP比较

注：☆与对照组造模后即刻比较，P<0.05；★与同一组别造模前比较，P<0.05；△与同一组别造模后即刻比较：给药组P<0.05。

2.2 补精益视片对SD大鼠慢性EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表达的影响见表2(图1)

经检验，三组总面积、积分光密度、平均光密度差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较：模型组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组低于模型组，差异有统计学意义 (P<0.05)。选取免疫组化法检测的三组SD大鼠PVC中磷酸化FoxO1表达的典型光镜图见图1(400×)。

表2 补精益视片对SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化FoxO1表达的影响

注：☆与对照组比较，★与对照组比较，△与模型组比较，均为P<0.05。

图1 各组大鼠PVC中磷酸化FoxO1含量(免疫组化×400)

2.2 补精益视片对SD大鼠慢性EIOP模型PVC中磷酸化IKK2表达的影响见表3(图2)

经检验，三组总面积、积分光密度、平均光密度差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较：模型组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组低于模型组，差异有统计学意义 (P<0.05)。选取免疫组化法检测的三组SD大鼠PVC中IKK2表达的典型光镜图见图2(400×)。

表3 补精益视片对SD大鼠EIOP模型PVC中磷酸化IKK2表达的影响

注：☆与对照组比较，★与对照组比较，△与模型组比较，均为P<0.05。

图2 各组大鼠PVC中IKK2含量(免疫组化×400)

3 讨论

青光眼类似中医“五风内障”及“青盲”，多由风、火、痰、郁、虚等导致气血失和、气滞血瘀、玄府闭塞、神水瘀积为病，病久肝肾两亏，神光衰微甚至泯灭、不睹三光而成“青盲”，所以肝肾虚损、脉络瘀滞是青光眼视功能损害的主要病机，滋养肝肾、活血化瘀为防治青光眼视神经损害的基本方法[7]。

补精益视片(组成：枸杞子、菟丝子、楮实子、五味子、丹参、三七、车前子、茺蔚子、木瓜、青皮)是根据陈达夫教授经验制成的成都中医药大学附属医院院内制剂。方中枸杞子、菟丝子、楮实子、五味子滋养肝肾、益精明目，丹参、三七活血化瘀、通利血脉，车前子、茺蔚子、楮实子利水渗湿、助降眼压，木瓜、青皮行气通络、消积化滞而使全方补而不滞，且气行则血行，有助活血通络，全方共奏滋养肝肾、活血化瘀功效。我们前期工作发现[8-12]：补精益视片治疗眼压控制后青光眼疗效确切，可不同程度改善患者中医症状，提高视力、视觉敏感度，有效控制视野缺损，从而保护青光眼患者视功能；可降低慢性EIOP模型大鼠眼压、提高RGCs数量，增加视网膜厚度，改善RGCs超微结构，上调视网膜PI3K/Akt信号转导通路中p-Akt的表达，促进LGN中BDNF的表达、提高尼氏小体含量，保护慢性EIOP模型SD大鼠的视功能。

近年来，关于PI3K/Akt信号通路(磷酸肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶，phosphatidylinostiol 3′-OH kinase/ protein kinase B，PI3K /Akt)调控细胞凋亡研究较多。Akt在PI3K调控下激活后，通过多种途径对细胞凋亡进行调控：①抑制NF-κB、FoxOs等转录因子的活性，调控凋亡；②磷酸化Bad、抑制caspase-9的磷酸化过程、抑制GSK-3活性，抑制凋亡；③抑制线粒体相关功能，抑制凋亡等[13]。FoxO1是FOX亚家族FoxO家族的一员，其磷酸化后会由细胞核转移到细胞质中，与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白结合，抑制细胞正常的周期、损伤修复及代谢活动，从而导致细胞周期停滞和凋亡[14-16]。IKK2为IKK的催化亚基[17]，是细胞因子介导的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化所必须的亚基结构[18]，而NF-κB在生物体内各种类型的细胞中均存在，对细胞的凋亡具有双向调节作用。有研究证明IKK/NF-κB信号通路在中枢神经系统疾病中对起着重要作用，在神经细胞的凋亡过程中发挥着重要作用[19]。

本实验结果显示：采用烙闭上巩膜静脉法[4]建立的SD大鼠慢性EIOP模型可以使大鼠IOP升高，且可维持至少8周(实验结束时)，说明造模成功，且此法可以获得较长、稳定的高眼压，与路雪婧等结果一致[20]；予以补精益视片后，SD大鼠慢性EIOP模型眼压有所降低；造模后SD大鼠慢性EIOP模型初级视皮质促凋亡因子p-FoxO1及IKK2表达明显升高，予以补精益视片后，SD大鼠慢性EIOP模型p-FoxO1及IKK2表达明显降低。以上结果说明，补精益视片具有保护SD大鼠慢性EIOP模型视功能的作用，推测其机制可能为：降低IOP，减少初级视皮质p-FoxO1及IKK2表达。