超声波辅助亚麻籽粕醇法脱色的研究

田博宇 焦英帅 姚亚亚 赵安鹏 李慧静

(河北农业大学食品科技学院，保定 071001)

亚麻是一年生草本植物，可细分为纤维用亚麻、油用亚麻和油纤兼用亚麻3种类型，其中油用亚麻又称之胡麻。油用亚麻主要种植于加拿大、中国、阿根廷、美国，其种子可榨油，是世界十大油料作为之一，年产油量位列第七。油用亚麻在中国有广泛种植，主要分布于华北、西北东北高寒地区，目前已是我国第四大油料作物[1]。长期以来，虽然油用型亚麻在我国广有种植，但营养、安全、健康的优质亚麻籽油却长期被大众忽视。随着亚麻籽中生物功能性成分的开发和亚麻籽精深加工的延伸，亚麻种植面积和亚麻籽产量将迎来新的增长动力。亚麻籽粕是亚麻籽经过溶剂浸提或冷法压榨提油后的残余物，其中粗蛋白质量分数约为23%～33%，是优质的植物蛋白资源。然而，亚麻粕直接用于动物饲料或沤制后作为植物肥料，这使得其中的营养成分未得到充分利用，造成了极大的资源浪费和经济损失。

目前，学者们对于植物蛋白提取方法已经有了深入研究，主要有碱溶酸沉法、超声波法、复合酶法、有机溶剂提取法[2]。碱溶酸沉法是利用多数植物蛋白等电点在酸性范围，而在碱性条件下植物蛋白会从植物细胞中溶出，后期利用酸调节蛋白提取液pH值至蛋白等电点，使蛋白外层电荷破坏而聚集析出。该法在亚麻籽粕蛋白提取工艺报道中广泛使用，同时此法因加工成本低、生产工艺便捷深得企业工业化制备亚麻蛋白所喜爱。但综合以前报道，亚麻蛋白提取主要关注其提取率，对制备蛋白色泽品质却少有报道，本实验室在以冷榨亚麻籽粕，采用碱溶酸沉法制备亚麻粕籽蛋白时发现，获取的亚麻蛋白呈现青褐色，且以碱溶pH 条件增加对蛋白色泽品质劣变尤为严重。分析原因，通过碱溶酸沉法制备亚麻粕蛋白时，部分色素会随着蛋白沉淀而富集。同时在碱溶酸沉工艺流程中，大量的碱液会使酚类物质氧化为醌[3]，进而造成最终蛋白色泽劣变，使其在食品中应用受限。而亚麻籽中亚麻木酚素，通常约占籽质量的0.9%～1.5%[4-5]，比其他已知富含木酚素的66种食品高100～800倍，这使得酚转化为醌造成的亚麻籽粕蛋白色泽劣变较其他植物蛋白生产问题尤为突出。因此必须在制备过程中进行适度脱色，目前对于不同原料脱色以吸附法和萃取法较为广泛。陆晨等[6]研究了活性炭对茶渣中植物蛋白吸附能力，发现在蛋白白度同产率相互制约，且当脱色率达到90%时，蛋白损失率超过60%。郑仕远等[7]采用苯、汽油、丙酮、乙醚等对蚕蛹脱色，虽效果不错，但存在环境污染和有机试剂成本过高等不足。无水乙醇是食品工业常见的有机溶剂，低毒、成本低、易操作，同时乙醇可以通过复蒸法回收反复利用，符合大规模工业生产要求。

超声波是一种频率高于2 kHz的声波。超声波提取技术是指将超声波所产生的空化、搅拌、振动等综合效应应用于天然有效成分提取中[8]。利用声能，破坏细胞壁、细胞膜，高效便捷的从原料中提取内容物。此外超声波辅助提取技术不受地域和原料限制，适用于与大多数天然成分提取。综合经济效益，超声波辅助提取是一种高效、节能、便捷的高新技术[9]。本研究从实际加工条件，确定了以超声波辅助冷榨亚麻籽粕水醇法脱色后进行蛋白提取的工艺流程。亚麻籽粕白度同蛋白提取率互相影响，需结合实际生产情况选取脱色条件。通过单因素及正交实验优化亚麻粕脱色工艺条件，以期为生产出品质优良的亚麻籽粕蛋白提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷榨亚麻籽粕，中药粉碎机粉碎过80目筛后备用。氢氧化钠、浓盐酸、磷酸、无水乙醇、氯化钠、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白均为分析纯试剂。

1.2 仪器设备

SD5200H液晶超声波清洗器；L3660D低速离心机；HH-601超级恒温水浴；ZNCL-S140X140磁力搅拌器；STARTER3100型pH计；752N紫外-可见分光光度计；WSB-VI型智能白度测定仪。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白含量测定

粗蛋白的测定：凯氏定氮法，GB/T 9823—2008《粮油检验 植物油料饼粕总含氮量的测定》，其中氮换算指数为6.25。

1.3.2 亚麻籽粕脱色效果测定

超声波辅助水醇法脱色亚麻籽粕经冷冻干燥(冷阱温度-35 ℃, 干燥室真空度30 Pa)后，研碎后测定白度。

1.3.3 脱色亚麻籽粕蛋白的提取

准确称取5.000 g脱色亚麻籽粕至于双层夹套烧杯中，按料液比1∶20加入蒸馏水，用0.1 mol/L、1 mol/L NaOH调节溶液至pH 9，60 ℃水浴，每隔10 min调节1次pH，碱提60 min后，4 200 r/min 转速下离心20 min，取上清液备用。

1.3.4 蛋白提取率测定

蛋白提取率测定：采用考马斯亮蓝法[10]，将提取液用蒸馏水稀释20倍，取稀释液0.1 mL于试管中，零参管以0.1 mL 0.15 mol/L NaCl 代替，再加入考马斯亮蓝G-250染色液5 mL，振荡摇匀，室温静置10 min后，在595 nm处测定吸光值。以牛血清白蛋白为标准品测定的标准曲线为：y=1.10878x-0.010 34,R2=0.991 9。固体中蛋白质含量参照GB/T 9823—2008进行测定。

1.3.5 亚麻籽粕脱色单因素实验

以乙醇浓度、料液比、水浴温度、超声波处理时间为考察因素，以脱色后亚麻籽粕白度和蛋白提取率为评价标准，确定各个因素对亚麻籽粕脱色效果影响。

1.3.5.1 乙醇浓度的影响

在水浴温度30 ℃、料液比1∶20、超声波处理时间20 min的条件下，乙醇体积分数分别为10%、20%、30%、40%、50%时进行单因素实验，根据脱色后亚麻籽粕白度及蛋白提取率确定较优乙醇浓度。

1.3.5.2 料液比的影响

在水浴温度30 ℃、乙醇体积分数20%、超声波处理时间20 min的条件下，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30时进行单因素实验，根据脱色后亚麻籽粕白度及蛋白提取率确定较优料液比。

1.3.5.3 水浴温度的影响

在料液比1∶20、乙醇体积分数20%、超声波处理时间20 min的条件下，水浴温度分别为10、20、30、40、50 ℃时进行单因素实验，根据脱色后亚麻籽粕白度及蛋白提取率确定较优水浴温度。

1.3.5.4 超声波处理时间的影响

在料液比1∶20、乙醇体积分数20%、水浴温度30 ℃的条件下，超声波处理时间分别为5、10、15、20、25 min时进行单因素实验，根据脱色后亚麻籽粕白度及蛋白提取率确定较优超声波处理时间。

1.3.6 正交实验

优化亚麻籽粕脱色条件，在单因素试验基础上，通过L9(34)正交实验进一步优化亚麻籽粕脱色条件，正交实验因素及水平表见表1。

表1 正交实验因素及水平表

1.3.7 数据统计方法

采用 SPPS17.0 软件对实验数据进行方差分析(ANOVA)，多组实验数据见差异性比较选用Duncan检验，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同单因素对于亚麻籽粕脱色效果影响

2.1.1 乙醇浓度对亚麻籽粕脱色效果的影响

乙醇浓度对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响如图1所示。

图1 乙醇浓度对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响

结果显示，随着乙醇浓度的增加，亚麻籽粕白度先增加后减小白度在乙醇体积分数为20%时最大，分析其原因在于随着乙醇浓度增加，原有亚麻籽粕中的色素及酚类物质适量脱除，使得亚麻籽粕白度增加，但过高的乙醇浓度同样会使亚麻籽粕中蛋白发生变性，进而使亚麻籽粕颜色发生劣变。蛋白提取率随着乙醇浓度增加呈现一定上升趋势，但各个组别间差异不显著，且考虑到高浓度乙醇会使蛋白因外部水化层破坏而发生变性。故综合分析乙醇浓度增加最亚麻籽粕白度及蛋白提取率影响，确定乙醇体积分数为20%较为合适。

2.1.2 料液比对亚麻籽粕脱色效果的影响

料液比对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响如图2所示。

图2 料液比对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响

结果显示，随着料液比加大，亚麻粕白度呈现上升趋势，其原因在于随着料液比加大，溶液中C2H5OH净含量增加，有助于色素及酚类物质脱除。但蛋白提取率同白度增加趋势相反，原因在于，随着料液比加大，水溶性蛋白损失增加，进而影响最终蛋白提取率。综合考虑，料液比应控制在1∶25。

2.1.3 水浴温度对亚麻籽粕脱色效果的影响

水浴温度对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响如图3所示。

图3 水浴温度对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响

结果显示，随着温度升高，亚麻粕白度呈现上升趋势，但温度在40 ℃后，白度上升速率减缓，分析其原因在于原有亚麻籽粕中呈色物质下降到阈值后，温度升高对亚麻籽粕白度影响不显著。蛋白提取率总体随着温度升高呈现倒“V”形，分析亚麻籽粕蛋白提取率随着脱色温度升高而增加的原因在于亚麻籽粕中蛋白在此期间有适当析出,因此后期蛋白提取过程中其蛋白提取液蛋白浓度增高，但在30 ℃后，脱色实验温度升高，使得蛋白溶解于亚麻籽粕脱色液中，进而使得最终蛋白提取率降低。综合考虑，水浴温度确定为30 ℃。

2.1.4 超声波处理时间对亚麻籽粕脱色效果的影响

超声波处理时间对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响如图4所示。

图4 超声波处理时间对亚麻籽粕白度及蛋白提取率的影响

结果表明，随着随着超声波处理时间延长，亚麻籽粕白度呈现上升趋势，蛋白提取率呈现下降趋势，但是各组数据间差异均不显著。综合考虑，超声波时间确定在15 min左右。

2.2 正交实验结果

通过单因素实验发现，脱色亚麻籽粕的白度同蛋白提取率基本呈负相关，且各因素对两者影响又存在差异，说明各单因素之间同样存在影响。为了进一步优化超声波辅助水醇法亚麻籽粕脱色条件，根据各单因素数据分析结果，亚麻籽粕脱色正交实验结果见表2。

表2 亚麻籽粕脱色正交实验结果

白度主体间效应检验见表3，由表3可得，矫正模型的显著水平小于0.01，表明模型显著性极好。乙醇浓度、水浴温度两因素的显著水平均小于0.01，说明乙醇浓度和水浴温度对亚麻籽粕白度有极显著影响。料液比因素的显著水平小于0.05，说明料液比对亚麻籽粕白度有显著影响。超声波处理时间因素的显著水平大于0.05，说明超声波处理时间对亚麻籽粕白度无显著影响。通过比较分析确定出最优组合为A2B1C3D3。由表4可得，矫正模型的显著水平小于0.01，表明模型显著性极好。乙醇浓度、料液比两因素的显著水平均小于0.01，说明乙醇浓度和料液比对脱色亚麻籽粕蛋白提取率有极显著影响。水浴温度、超声波处理时间两因素的显著水平均小于0.05说明水浴温度和超声波处理时间对脱色亚麻籽粕蛋白提取率有显著影响。通过比较分析确定较优组合为A2B2C3D3、A2B3C3D3。从两者最优组合来看实验设计各因素相互制约，互为影响。需要综合分析，选取符合实际生产需要的脱色条件。本实验综合分析亚麻籽粕白度和和脱色亚麻籽粕蛋白提取率，选择正交实验第5组方案(A2B2C3D1)为较优组合，即乙醇体积分数20%、料液比1∶25、水浴温度40 ℃、超声波处理时间10 min，此条件下亚麻籽粕白度为46.80，脱色亚麻籽粕蛋白提取率为43.84%。

表3 白度主体间效应检验

表4 蛋白提取率主体间效应检验

2.3 验证实验

在3个烧杯中分别准确称取10.000 g亚麻籽粕，按料液比1∶25加入乙醇溶液，水浴温度30 ℃，超声波处理10 min后，4 200 r/min 转速下离心4 min，取沉淀冷冻干燥(冷阱温度-35 ℃，干燥室真空度30 Pa)后测定白度。

准确称取5.000 g脱色亚麻籽粕于双层夹套烧杯中，按料液比1∶20加入蒸馏水，用0.1 mol/L、1 mol/L NaOH调节溶液至pH 9，60 ℃水浴，每隔10 min调节1次pH，碱提60 min后，4 200 r/min 转速下离心20 min，取上清液备用。验证实验结果见表5。

表5 验证实验及结果

结果表明，采用超声波辅助法进行亚麻籽粕脱色的白度及蛋白提取率分别为46.77%和43.96%，变异系数分别为1.50%和1.00%，实验数据具有较好重复性，说明此方法稳定可靠。

2.4 讨论

冷榨亚麻籽粕磨粉80目过筛后，测定白度为17.01，粗蛋白质量分数为32.71%，以此为原料获取的亚麻籽粕蛋白为青褐色。通过预实验，比较对亚麻籽粕超声波辅助水醇法脱色后进行蛋白提取、提取亚麻籽粕蛋白后进行超声波辅助水醇法脱色2种工艺流程，发现因为亚麻籽粕中富含亚麻籽胶[11]，若采用后者工艺流程会导致蛋白提取液酸沉阶段，蛋白难以离心，故而确定工艺流程为对亚麻籽粕先脱色后进行蛋白提取。实验表明，亚麻籽粕白度同蛋白提取率相互制约，亚麻籽粕白度通常同脱色条件加剧而增加，但剧烈的条件同样会引起亚麻籽粕蛋白变性以及蛋白提取率降低，需要结合生产实际情况已经经济成本确定适当条件。

3 结论

经过正交实验优化并综合考虑亚麻籽粕白度和脱色亚麻籽粕蛋白提取率，本实验确定乙醇体积分数20%、料液比1∶25、水浴温度40 ℃、超声波处理时间10 min为最适脱色条件，此条件下亚麻籽粕白度为46.80，脱色亚麻籽粕蛋白提取率为43.84%。