刺参不定根不同溶剂萃取物的抗氧化活性研究

田 文， 韩 璐， 高 原， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

刺参(OplopanaxelatusNakai)又名东北刺人参，为五加科刺人参属，多年生落叶灌木，是长白山地区珍贵的濒危药用植物之一，国家二级重点保护植物，也称为“木本人参”[1]。刺参中含有多种生物活性物质，主要有多糖类、多酚类、黄酮类、皂苷类、蒽醌类、挥发油、不饱和脂肪酸和微量元素等[2-3]，具有抗肿瘤、抗真菌、抗氧化、抗炎、抑制黑色素生成及提高免疫力等药理作用[4-8]。

生物体在生理代谢过程中会产生一系列活性氧自由基(ROS)，适量的自由基有助于清除病原微生物、抑制癌细胞等，但是过多的ROS会造成包括膜脂、蛋白质等细胞组分的损伤，甚至作用于细胞质中调节相关信号的表达。研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联，因此抗氧化自由基的产品研发及其重要[9-11]。目前，市场上抗氧剂主要分为人工合成抗氧剂与天然抗氧化剂，其中，人工合成抗氧化剂虽然成本低、抗氧化效果明显，但安全性低，对人体存在一定的毒害作用。而植物提取物是天然抗氧化剂，因其具有安全无毒等优点，逐渐成为抗氧化研究的热点[12-14]。

1 材料与方法

1.1 材料

参照李慧娟[18]的方法诱导和增殖培养东北刺人参不定根。将增殖培养的不定根切成1 cm大小，并称取80 g(鲜重)接种于含有16 L液体培养基的20 L气球型生物反应器中，培养基为MS+吲哚-3-丁酸(IBA)3.0 mg/L +蔗糖50 g/L，pH值5.8，通气量调节为100 mL/min，在25 ℃条件下进行暗培养。为了提高活性物质的积累，在培养30 d时向反应器内加入经滤膜过滤的茉莉酸甲酯(200 μmol/L)进行诱导处理，8 d后收获不定根。将反应器内收获的不定根在流水下冲洗，吸干表面水分后置于45 ℃恒温烘干箱中烘干48 h，收集不定根干品作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 刺参不定根不同溶剂萃取物的制备

刺参不定根萃取过程如图1。

图1 刺参不定根萃取过程

将磨碎的不定根干粉置于锥形瓶中，加入80%甲醇溶液(质量∶体积=1∶3)，37 ℃条件下超声提取1 h，过滤并收集滤液，重复3次并合并滤液，于45 ℃减压浓缩置于烘干箱干燥至恒重，即得不定根甲醇粗提物。取10 g甲醇粗提物用蒸馏水定容至100 mL，倒入体积为250 mL的分液漏斗，并加入100 mL正己烷，充分摇匀，静止分层后取上层溶液即为正己烷萃取液；继续收集下层溶液并倒入250 mL液漏斗中，加入100 mL二氯甲烷，充分摇匀，静止分层后取下层溶液即为二氯甲烷萃取液。继续收集上层溶液，倒入250 mL分液漏斗中，加入100 mL乙酸乙酯，充分摇匀，静止分层后取上层溶液即为乙酸乙酯萃取液；继续收集下层溶液，加入100 mL正丁醇溶液，充分摇匀，静止分层后取下层溶液即为正丁醇萃取液，并收集上层水溶液(图1)。分别将正己烷萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及水层溶液于45 ℃减压浓缩至膏状，冷冻干燥至恒重后，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 DPPH自由基清除能力研究

参照Sarikurkcu等[20]的方法，精密称取不同不定根萃取物与甲醇粗提物50 mg，用甲醇溶液定容至50 mL，依次稀释为0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25.6、50、100 μg/mL，分别量取2 mL上述样品至试管中，加入2 mL浓度为0.1 mM的DPPH溶液，避光反应30 min，以甲醇溶液作对照组，利用紫外分光光度计在517 nm处测定吸光度。计算DPPH自由基清除能力，公式为：

I/%=(A对照-A样品)/A对照×100%

1.2.3 铁离子鳌合能力研究

参照Fu等[21]的方法并作改进，精密称取不同不定根萃取物与甲醇粗提物1 g，用蒸馏水溶解并定容至10 mL，依次稀释为0.2，0.3，0.6，1.3，2.5，5.0，10.0 μg/mL。分别量取1 mL至试管中，加入2.75 mL 蒸馏水和0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液，摇匀，加入0.2 mL、5 mmol/L的啡咯嗪，室温静置10 min。以0.05 mL蒸馏水代替0.05 mL FeCl2溶液为对照组，以0.05 mL蒸馏水代替0.05 mL样品稀释液为空白组，利用紫外分光光度计在562 nm处测定吸光度，计算铁离子鳌合能力，公式为：

I/%=[1-(A样品-A对照)/A空白]×100%

1.2.4 铁离子还原力研究

根据Oyaizu等[22]的方法并做改进。取不定根萃取物与甲醇粗提物(浓度依次稀释为 0，25，50，100，200，400，800 μg/mL)2.5 mL于试管中，加入pH值为6.6的0.2 mol/L PBS缓冲液2.5 mL和1% K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL，充分混匀，50 ℃条件下水浴20 min，冷却至室温后加入10%三氯乙酸(TCA)溶液2.5 mL。混匀后，5 000 rpm/min下离心15 min，取5 mL上清液，加入0.1% FeCl3溶液1 mL，反应5 min后，利用紫外分光光度计在700 nm处测定吸光度，计算铁离子还原力，公式为：

铁离子还原力=(A样品-A对照)-A空白

2 结果与分析

2.1 不定根提取物对DPPH自由基清除能力的影响

对DPPH自由基清除能力进行检测的结果发现，提取物的浓度与DPPH自由基清除能力呈正相关(图2)。当提取物的浓度升高时，对DPPH自由基清除能力也随之增强，当乙酸乙酯萃取物在最低浓度0.8 μg/mL时，清除率超过20%，但当提取物达到150 μg/mL后，自由基清除能力不再升高，且保持在最高清除能力。

图2 不定根提取物对DPPH自由基清除能力的影响

比较各萃取物DPPH自由基半最大效应浓度(EC50)的结果，乙酸乙酯萃取物EC50最低，为7.5 μg/mL，依次是正丁醇萃取物(EC50=17.50 μg/mL)、甲醇粗提物(EC50=29.71 μg/mL)、二氯甲烷萃取物(EC50=34.48 μg/mL)、水层浓缩物(EC50=45.00 μg/mL)、正己烷萃取物(EC50=67.86 μg/mL)(表1)。由此可见，乙酸乙酯萃取物的DPPH自由基清除能力显著好于其他萃取物。

表1 不定根萃取物DPPH清除能力比较

2.2 不定根提取物对铁离子鳌合能力的影响

评价不定根萃取物对铁离子螯合能力的影响发现(图3)，不定根甲醇粗提物和5种萃取物均是良好的铁离子螯合剂，随着萃取物浓度的升高，铁离子螯合能力也逐渐增强。当萃取物达到10 μg/mL浓度后，铁离子螯合能力将保持在稳定水平。

比较各萃取物Fe3+鳌合能力EC50时，效果最为显著的是乙酸乙酯萃取物(EC50=0.81 μg/mL)。其次是正己烷萃取物(EC50=1.05 μg/mL)、正丁醇萃取物(EC50=1.77 μg/mL)、水层浓缩物(EC50=2.98 μg/mL)、甲醇粗提物(EC50=3.01 μg/mL)、二氯甲烷萃取物(EC50=3.21 μg/mL)(表2)。

图3 不定根萃取物对铁离子鳌合能力的影响

表2 不定根萃取物的铁离子鳌合能力比较

2.3 不定根萃取物对铁离子还原能力的影响

对不定根萃取物Fe2+还原力进行测定发现(图4)，A700nm(紫外分光光度计700 nm处的吸光值)越大，说明还原能力越强。结果显示，6种不同提取物均表现出良好的铁离子还原能力，且随着提取物浓度升高呈增强的趋势。

经比较发现，当萃取物浓度均为800 μg/mL时，作用效果最好的是乙酸乙酯(A700 nm=1.13)，其次分别是正丁醇萃取物(A700 nm=1.10)、甲醇粗提物(A700 nm=0.95)、水层浓缩物(A700 nm=0.89)、二氯甲烷萃取物(A700 nm=0.77)、正己烷萃取物(A700 nm=0.62)(表3)。

图4 不定根萃取物对铁离子还原能力的影响

提取物还原能力(A700 nm)甲醇粗提物0.95二氯甲烷萃取物0.77乙酸乙酯萃取物1.13正己烷萃取物0.62正丁醇萃取物1.10水层浓缩物0.89

3 讨论与结论

研究发现，植物中的黄酮类化合物[23]、多糖类化合物[24]、多酚类化合物[25]均具有抗氧化活性。但由于不同溶剂的极性不同，导致植物活性物质在不同溶剂中的溶解度不同，各萃取物的有效活性物质含量也不同，不同溶剂萃取物的抗氧化能力也有所差异[26]。何静等[27]对莲蓬壳提取物依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂进行萃取获取5种萃取物，且乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力强于其他溶剂萃取物；周瑞等[28]发现，黄参的不同溶剂萃取物对DPPH自由基表现出不同的清除能力，其中乙酸乙酯萃取物对DPPH自由基清除能力最强，这与本研究结果相同。本研究以生物反应器培养的刺参不定根为原材料，分别利用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇对其甲醇提取物进行萃取，并通过体外抗氧化实验研究了各萃取物的抗氧化活性。结果显示，刺参不定根不同萃取物均具有良好的抗氧化能力，并随着浓度的升高效果越明显，乙酸乙酯萃取物的DPPH清除能力、铁离子鳌合能力的EC50分别为7.5和0.81 μg/mL，铁离子还原力A700 nm测定为1.13，表现出较强的抗氧化能力。综上所述，刺参不定根提取物是一种天然的抗氧化剂，且乙酸乙酯萃取物抗氧化能力最强。