种子真空侵染法遗传转化体系的建立与优化

杨丽萍, 王 悦, 孟大伟, 吴艳菊, 金太成

(吉林师范大学 生命科学学院，吉林 四平 136000)

植物的稳定遗传转化方法已经被广泛的应用于植物品种的改良，其中，最常用的2种方法是农杆菌介导法和基因枪法。基因枪法导入的外源基因存在拷贝数较多及遗传不稳定等缺点，大多数植物的遗传转化采用农杆菌介导法来导入外源基因。

自从1983年人们利用农杆菌介导的遗传转化法将外源基因导入烟草(Nicotianabenthamiana)中获得成功以来，人们多次利用叶盘转化法获得转基因烟草[1-3]，因其转化周期短、易于培养和转化效率高等优点而被广泛应用。近年来，利用农杆菌介导遗传转化技术改变了植物形态特征，提高了作物的品质性状、代谢功能及非生物胁迫等[4-5]。Vasil和Webb首次提出利用农杆菌介导的遗传转化技术将外源基因导入牧草中，并获得转基因苜蓿[6-7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上分布最广的一种牧草，具有适应性强和干草产量高等优点[8]。由于紫花苜蓿的体细胞难培养、再生周期长、转化效率低等特点，研究者对转基因苜蓿的研究受到了限制。目前，植物遗传转化技术已经成为重点研究内容。干旱胁迫和盐胁迫等严重影响了植物生长，进行苜蓿品种的抗逆性育种研究已经迫在眉睫[9]。苜蓿的离体再生途径主要有体细胞胚发生途径和器官发生途径。其中，通过器官发生途径获得转基因植株的研究已有成功的报道[10]，而大多数苜蓿再生体系是通过胚状体发生途径来获得苜蓿再生植株[11-12]。

本研究以拟南芥(Arabidopsis)和紫花苜蓿作为材料，研究了农杆菌浓度、侵染压力等对转化的影响，旨在建立一种快速、高效的稳定表达体系，为植物遗传转化体的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

拟南芥种子用无菌水清洗干净，将其放在铺有湿润纱布的培养皿上进行发芽，每个培养皿中培养50粒种子，温度设置为25 ℃，光照条件设置为16 h光照，8 h黑暗，相对湿度设置为80%。待发芽种子长到1 cm左右时作为试验材料。

1.2 真空侵染体系的建立与优化

首先对农杆菌细胞浓度OD600进行优化，将农杆菌重悬液的浓度设为OD600=0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6，真空侵染压力0.07 MPa，真空侵染时间3 min。

对发芽种子进行真空侵染，真空侵染压力的大小也会影响农杆菌的侵染效率。将发芽种子置于含有农杆菌重悬液OD600=1.2的培养皿中，真空侵染压力分别设为0.05、0.06、0.07和0.08 MPa侵染3 min。将上述进行真空侵染的发芽种子播种于花盆中，培养15 d后检测GUS表达效率(表达GUS植株占总株数的百分比)。

1.3 拟南芥真空侵染植物的GUS染色

通过GUS染色法鉴定外源基因的表达，取1个1.5 mL的离心管，放入转基因拟南芥幼苗的根茎叶，加入适量配置好的GUS染液，至完全没过植物材料，在离心管上做好标记后用锡箔纸包裹，常温放置3 h；把上述材料转入75%酒精中脱色2～3次，每次处理时长为1 h，直至叶片无绿色，显微镜下观察拍照。

1.4 紫花苜蓿GUS基因表达的检测

利用上述优化的条件对紫花苜蓿进行了遗传转化，并在转录水平上检测GUS表达。提取紫花苜蓿总RNA，将2 μg RNA溶解于50 μL ddH2O中，4 ℃放置10 min。然后按照TaKaRa反转录试剂盒的操作方法进行RT-PCR检测，试验中使用GUS基因的探针引物。

2 结果与分析

2.1 拟南芥中发芽种子真空侵染体系的优化

2.1.1 农杆菌OD600浓度对真空侵染效率的影响

拟南芥发芽种子真空侵染过程中，外源基因的表达会受到农杆菌菌液浓度和真空侵染压力的影响。以GUS的表达效率(表达GUS的植株占总株数的比率)来优化这些影响外源基因表达的重要条件。

利用植物发芽种子进行真空侵染，外源蛋白的表达效率主要受菌液浓度的影响。研究发现，GUS表达效率最高值出现在农杆菌重悬液OD600=1.2时，表达效率最高(65%)；农杆菌重悬液OD600=0.6时，GUS的表达效率较低(32%)；农杆菌重悬液OD600=1.6时，GUS的表达效率较低(42%)，这表明菌液浓度过高或者浓度过低时，都会影响农杆菌的侵染效率(图1A)。

2.1.2 压强对真空侵染效率的影响

影响GUS表达效率的另一重要因素是真空侵染压力，GUS的表达效率随着真空侵染压力的增大而增大；当真空侵染压强为0.05～0.06 MPa时，GUS的表达效率较低(34%～42%)，当真空侵染压强为0.07 MPa时，GUS在发芽种子中表达效率最高，为65%(图1B)。

注：A: 拟南芥植物中农杆菌细胞浓度对GUS表达效率的影响；B: 拟南芥植物中真空侵染的压力对GUS表达效率的影响

图1 拟南芥植物中发芽种子真空侵染法的优化

Fig.1 Optimization of germinated-seedvacuum infiltration in Arabidopsis plants

2.1.3 拟南芥中GUS基因表达的检测

发芽种子真空侵染后第15天，对GUS转基因拟南芥植株进行GUS组织化学法染色，以野生型拟南芥(Col-0)作为对照(图2A)，发现在GUS转基因拟南芥染色较深(图2B)，而野生型拟南芥(Col-0)植株未被染色(图2C、E)。GUS染色的检测结果表明，GUS在拟南芥植物材料中获得了有效表达，而且在叶片和根部位表达量较高(图2D、F)。

注：A-野生型拟南芥(Col-0)作为对照；B-转基因拟南芥小苗中GUS染色的观察；C-野生型拟南芥(Col-0)叶片作为对照；D-转基因拟南芥叶片中GUS染色观察；E-野生型拟南芥(Col-0)根作为对照；F-转基因拟南芥根中GUS染色观察。

图2 转基因拟南芥中GUS基因表达的检测

Fig.2 The detection ofGUSgene expression in Arabidopsis plants

2.2 紫花苜蓿中GUS基因表达的检测

利用发芽种子真空侵染法遗传转化紫花苜蓿，随机选取紫花苜蓿提取总RNA，并在转录水平上对GUS基因的表达进行RT-PCR检测。检测结果表明：选取的紫花苜蓿中GUS基因均获得成功表达(100%)(图3)，表明这种遗传转化方法可以用于紫花苜蓿遗传转化。

注：M-DL2 000 Marker；1～5：植物中基因表达的检测

图3 紫花苜蓿植物中GUS表达的RT-PCR检测

Fig.3 RT-PCR detection ofGUSexpression inM.sativaplants

3 讨论与结论

植物的遗传转化已经是一项比较成熟的生物技术，但由于农杆菌介导的叶盘转化法试验周期长，需要投入大量的时间和精力去建立和优化每一种植物的遗传转化体系。因此，建立高效、快速的植物稳定转化体系将成为一个研究热点。真空侵染法常被用于植物表达外源蛋白的研究中，范亚军等[13]利用真空侵染技术在豌豆发芽种子中表达了绿色荧光蛋白GFP，在农杆菌细胞浓度OD600=1.5、压强为0.08 MPa的侵染条件下，外源基因表达的效率最高。本研究在拟南芥中建立了一种高效快速的表达外源基因的方法，并对侵染条件进行了优化，当农杆菌细胞浓度OD600=1.2，真空侵染压强为0.07 MPa时，GUS基因在拟南芥植物中表达的效率较高。此外，真空侵染时间、植物种子发芽后的侵染时期也会影响外源基因的表达效率。

紫花苜蓿作为多年生豆科牧草，因其产量高、营养丰富等优点，被称为“牧草之王”。培育耐盐抗逆苜蓿新品种对于改良吉林省西部盐碱草地具有重要意义。苜蓿的遗传转化多采用农杆菌介导的叶盘转化法，周期较长，实验过程较为复杂。徐博等[14]以紫花苜蓿为材料，建立并优化了遗传转化体系。本研究组之前的研究表明，农杆菌介导的叶盘转化法能够有效完成植物的遗传转化过程，但实验周期较长，一般需要6～12月的实验过程[15-18]。因此，本研究目的是在紫花苜蓿中建立一种简单、快速、高效的遗传转化体系，以减少遗传转化的研究周期。该研究以发芽种子作为真空侵染的材料，以在拟南芥和紫花苜蓿中成功地表达了外源基因，并对影响基因表达的条件进行了优化。RT-PCR检测结果表明，利用这种优化的体系在紫花苜蓿中有效表达了外源基因GUS。这种遗传转化体系具有简单、快速、高效的优势，为农杆菌介导的遗传转化方法提供了新的研究方法。该方法在产业化生产外源蛋白中具有极大的优势，使得遗传转化技术得到了更好的发展。