高效液相色谱法测定花生仁中甲咪唑烟酸残留

黄志勇 ，李汶鲜 ，陈艳 ，邹沫君 ，景赞 ，刘超

（1.四川省乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山614000；2.四川省乐山市沙湾区绥山初级中学，四川沙湾614900）

随着除草剂范转及使用量的增大，其在农作物中的残留，以及对人类健康和环境造成的毒害，也越来越被人们所关注[1,2]。甲咪唑烟酸（Imazapic）是一种咪唑啉酮类花生专用除草剂[3]。该类除草剂由于淋溶性强，易污染地下水，同时在土壤中残留时间较长，容易对后茬作物造成伤害[4,5]。我国对甲咪唑烟酸在部分农产品中的残留做出了严格的限量要求[6]。

目前针对花生仁中甲咪唑烟酸农药残留定量检测的标准方法是在GB 2763-2016标准中规定的参照GB 23200.13-2016的方法，该方法采用的是液相色谱-质谱测定茶叶中的多种农药残留[7]。花生仁基质因含有大量的油脂和蛋白质，因此与测定茶叶基质的方法有显著的区别，而且该方法仅仅是对甲咪唑烟酸的定性检测，标准峰出现了较为严重的肩峰。本试验在前人工作的基础上[8,9]，根据花生仁样品和甲咪唑烟酸性质结合文献资料分析[10]，建立了以乙腈：0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（加入0.1%的三乙胺，磷酸调pH3.0）体积比1：3作为流动相，采用实验室普及率较高的高效液相色谱（紫外检测器）定量检测其残留量。该方法操作简便、分离度好、结果准确，能很好地应用在对花生仁中甲咪唑烟酸残留量的定量检测上。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲咪唑烟酸（98.5%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈，色谱纯，北京北灵威科技有限公司；正己烷（色谱纯），成都市科龙化工试剂厂；三乙胺，色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；无水硫酸钠，分析纯，成都市科龙华试剂厂；磷酸二氢钾、磷酸，分析纯，成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

小型高速粉碎机，永康市天祺盛世工贸有限公司；CP225D电子天平，德国赛多利斯公司；TG-16台式高速离心机，四川蜀科仪器有限公司；组织捣碎匀浆仪，江苏金坛市环宇科学仪器厂；UPT-Ⅱ-10T超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；多参数测试仪，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；EV331旋转蒸发仪，莱伯泰科有限公司；岛津LC-20A高效液相色谱仪（配SPD-20A紫外检测器），日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

以甲醇为溶剂，配置浓度分别为 0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mg/L的甲咪唑烟酸标准系列溶液。经0.22 μm的有机微孔膜过滤，再进行HPLC分析，以甲咪唑烟酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 样品前处理

准确称取15 g匀浆后的花生仁样品于50 mL具塞离心管中，加入5 g无水硫酸钠、20 mL乙腈，在高速组织捣碎机上以15 000 r/min匀浆提取1 min，4 000 r/min离心5 min，上清液移入50 mL具塞离心管中。残渣再加20 mL乙腈重复提取1次，上清液并入50 mL具塞离心管中。向其中加入5 mL乙腈饱和的正己烷溶液，剧烈振摇1 min，静置分层，弃去上层正己烷溶液，取30 mL乙腈溶液于鸡心瓶中，50℃水浴，旋转浓缩至干，加入20%甲醇水溶液2 mL溶解，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：Thermo C18不锈钢柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为乙腈，B为0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液，其中加入0.1%的三乙胺，磷酸调pH 3.0，A、B的体积比为 1：3；等度洗脱，流速为 0.8 mL/min；柱温 25 ℃；进样体积5 μL；检测波长280 nm；外标法定量。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

流动相的组成成分各自的性质和浓度对目标物的色谱峰型和分离存在密切的关系。按照GB/T 23200.13-2006标准使用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为混合流动相时，按照1.4色谱条件进行分析，标准峰出现与上述国标类似的峰型较宽且存在不对称的情况。为此，根据甲咪唑烟酸结构特点结合相关文献，采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（加入0.1%的三乙胺，磷酸调pH3.0）体积比1：3作为改良流动相进行分析，结果显示标准峰型对称、峰宽较窄，如图1所示。

图1 甲咪唑烟酸对照品的色谱图Fig.1 Chromatograms of imazapic standard

2.2 标准曲线和检出限

按照1.4色谱条件对甲咪唑烟酸标准系列质量浓度进行测定，以标准峰面积（A）为纵坐标，标准系列质量浓度C（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线并作线性回归。得到的线性方程为A=9091.4C-47.816，线性相关系数R2=0.9999。在该法条件下甲咪唑烟酸的最小检出量为0.2 ng，方法检测限为 7 μg/kg。

2.3 方法学考察

2.3.1 重复性

以甲咪唑烟酸对照品加标浓度为0.1 mg/kg的阴性样品作为供试品溶液，平行制备6份，按照1.3.2的样品前处理，1.4色谱条件测定每份供试品的含量，注入液相色谱仪，记录峰面积，计算得甲咪唑烟酸的含量分别为0.098 3、0.098 5、0.097 7、0.098 6、0.099 1、0.098 1 mg/kg，RSD为0.49%，说明该方法重复性良好。

2.3.2 精密度

以甲咪唑烟酸浓度为0.01 mg/kg标准溶液做精密度测试，按照1.4色谱条件重复进样6次，记录峰面积分别为 406、394、407、396、397、407，RSD 为 1.6%，说明该方法精密度良好。

2.3.3 稳定性

以甲咪唑烟酸对照品加标浓度为0.1 mg/kg的阴性样品作为供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12 h后按照1.3.2处理，1.4色谱条件测定不同稳定时间供试品溶液中甲咪唑烟酸的含量分别为0.098 5、0.098 6、0.098 4、0.097 8、0.097 4 mg/kg，RSD为0.53%，说明该方法在12 h内稳定性良好。

2.3.4 加标回收率

准确称取未检出甲咪唑烟酸的阴性花生仁样品18份，将其分成3组，添加相当于样品含甲咪唑烟酸浓度分别为0.45、0.9、1.8 mg/kg的标准溶液，按本法进行提取、净化处理，分别做6次平行实验。对比阴性样品色谱图标准峰与杂质峰实现了很好的分离。各添加质量浓度平均回收率结果见表1所示，平均回收率在91.1%～98.9%之间，相对标准偏差（RSD）为0.43%～0.63%。结果表明该方法的回收率能满足测定要求。

表1 各添加量的平均回收率结果和RSD（n=6）Table 1 Addition standard recovery and RSD（n=6）

2.4 样品的检测

用上述方法测定了随机从当地超市购买的不同产地的花生仁样品10份，均未检出甲咪唑烟酸残留。

3 结论

建立了一种简便的高效液相色谱法检测花生仁中甲咪唑烟酸的方法。本方法对GB/T23200采用的乙腈-0.1%甲酸水溶液流动相进行了探讨，确定了乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（加入0.1%的三乙胺，磷酸调pH为3.0）（体积比1：3）作为新流动相，实现了对标准峰型的优化和与杂质峰的分离。结果表明，甲咪唑烟酸标准溶液在0～1.2 mg/L范围内线性良好（R2=0.9999），检出限为7 μg/kg。经过方法学的考察，其重复性、精密度、稳定性较好，并且在花生仁中甲咪唑烟酸标准限值（0.1 mg/kg）附近添加三个不同浓度分别为0.045、0.09、0.18 mg/kg，获得了 91.1%～98.9%的回收率，RSD为 0.43%～0.63%，适用于花生仁中甲咪唑烟酸残留量的定量检测。