南瓜籽发芽富集γ-氨基丁酸的培养条件优化

白青云，陈敏嫣，张化贤，赵立

（淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安223003）

南瓜籽（Semen Moschatae）是葫芦科草本植物南瓜的成熟种子，种类丰富，产量巨大。南瓜籽中含有丰富的多不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等营养成分，同时富含蛋白质，其中蛋白质含量可达35%以上。南瓜籽还具有一定的保健功能，如降血脂、抗氧化、抗炎、预防前列腺炎等疾病[1]。目前南瓜籽只是作为种子或者简单的休闲食品，附加值低。南瓜籽是一个活的有机体，在贮藏过程中不断进行新陈代谢等一系列的生物化学变化[2]，在适宜条件下会发芽变成芽类食品。由于种子在发芽过程中会提高维生素C、异黄酮等营养成分含量[3,4]，芽类食品成为食品界的新宠，研究较多的有发芽糙米[5]、发芽大豆[6]、发芽粟谷[7]和发芽蚕豆[8]等。目前发芽糙米已经达到了工业化生产水平[9]，而国内外对发芽南瓜籽研究的较少，所研究内容也仅限于发芽过程中南瓜籽生物学特性[10]和亚油酸含量变化[11]等方面。因此，开发芽类南瓜籽新产品，提高南瓜籽附加值，成为新的研究方向。

GABAγ-氨基丁酸是生物体内广泛存在的一种非蛋白质氨基酸，主要由谷氨酸（Glu）经谷氨酸脱羧酶（GAD EC 4.1.1.15）脱羧产生，是哺乳动物大脑抑制性神经递质。研究表明，利用谷物及果蔬中自身存在的谷氨酸脱羧酶，可富集对人体有保健作用的GABA[7,12]。GABA具有降血压、利尿、镇静神经、改善失眠以及肝肾功能活化等作用[13]。植物组织中GABA含量很低，不能满足人体需要，因此提高GABA含量的方法受到广泛关注。本研究以营养丰富的南瓜籽为原料，采用发芽法研究南瓜籽富集GABA的工艺条件，优化富集GABA的技术参数，为开发富含GABA的南瓜籽食品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南瓜籽，淮安市城南农贸市场；GABA标品，购自美国Sigma化学品公司；无水乙醇、冰醋酸、苯酚、次氯酸钠、氯化钙（CaCl2）、谷氨酸钠（MSG）、维生素B6（VB6）等购自国药化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TDL-40B型离心机，上海安亭仪器厂；V-1000型可见分光光度计，上海翔艺仪器有限公司；101-1BS型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；FK-A组织捣碎匀浆机，江苏省金坛市环宇科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 南瓜籽发芽工艺

称取一定量的南瓜籽，用1%次氯酸钠溶液消毒30 min，于25℃去离子水中浸泡6 h，将种子捞出吸去明水，置于垫有四层纱布的培养盘中，均匀铺开，在一定温度的培养箱中用配置的培养液浸渍避光培养一定时间，培养结束后取出样品，测定南瓜籽中GABA含量（鲜重）。

1.3.2 培养条件对南瓜籽富集GABA的影响

影响南瓜籽富集GABA的工艺主要有培养温度、培养时间和培养液pH，首先做单因素实验，设定培养温度范围为26～32℃，培养时间为24～84 h，缓冲液pH为4.6～7.0，在单因素实验的基础上，采用正交试验的三因素三水平试验设计，优化南瓜籽富集GABA的最佳发芽工艺。

1.3.3 培养液组分对南瓜籽富集GABA的影响

为进一步提高南瓜籽中GABA含量，在最佳发芽工艺基础上，在培养液中添加促进GABA富集的外源添加物MSG、VB6和CaCl2，研究各组分添加量对南瓜籽富集GABA的影响。各组分浓度范围设定为：MSG 2～10 mg/mL、VB60.1～0.9 mmol/mL、CaCl22.0～10.0 mmol/L。对影响南瓜籽GABA富集的添加物组分采用Box-Behnken design实验设计进行优化，以GABA含量作为考察值，得出南瓜籽富集GABA的最优培养液组分。

1.4 GABA测定方法

取发芽的南瓜籽样品磨碎后，精确称取1 g样品于20 mL离心管中，再加入6 mL 7%的乙酸提取1 h后，于4 000 r/min离心10 min，上清液中再加入4 mL无水乙醇沉淀30 min，4 000 r/min离心10 min后，上清液经旋转蒸发浓缩至干，用1 mL蒸馏水溶解后于10 000 r/min离心10 min，上清液用于测定GABA含量。参照白青云等[14]的方法，采用比色法测定样品中GABA含量。

1.5 数据统计与分析

试验设重复3次，结果以x±SD表示，采用设计专家Design expert7.0软件和SPSS16.0软件处理试验数据，进行方差分析和显著性检验。

2 结果与讨论

2.1 培养条件对南瓜籽中GABA含量的影响

2.1.1 培养温度对南瓜籽中GABA含量的影响

图1 培养温度对南瓜籽中GABA含量的影响Fig.1 Effect of culture temperature on GABA content of pumpkin seed

图1显示了培养温度对南瓜籽中GABA含量的影响，由图1可见，在26～32℃范围内南瓜籽用去离子水培养48 h，培养温度对南瓜籽中GABA含量有显著影响，呈先上升后下降的趋势，30℃时南瓜籽中GABA含量最高，为0.215 mg/g，分别比26℃和32℃提高109.18%和105.27%。由此表明，最适温度为30℃。

2.1.2 培养时间对南瓜籽GABA含量的影响

在温度30℃、培养液pH5.8的条件下南瓜籽中GABA含量随培养时间的延长而变化的情况见图2。从图2可以看出，随着培养时间的延长，南瓜籽中GABA含量呈先增加后降低的趋势，培养48 h含量最高，为0.217 mg/g，是刚开始培养（0 h）的2.94倍。因此，选择培养48 h为南瓜籽富集GABA的适宜时间。

图2 培养时间对南瓜籽中GABA含量的影响Fig.2 Effect of culture time on GABA content of pumpkin seed

2.1.3 培养液pH对南瓜籽中GABA含量的影响

在培养温度30℃、培养时间48 h的条件下，培养液pH对南瓜籽中GABA富集的影响结果见图3。研究表明，酸性环境下有利于植物GABA的富集[14]。由图3可知，pH在4.6～7.0之间，GABA含量随pH的升高先上升后下降。当pH为5.8时，GABA含量最高，分别是pH4.6和6.4时含量的2.34倍和2.57倍。因此，南瓜籽富集GABA的适合pH为5.8。

图3 培养液pH对南瓜籽中GABA含量的影响Fig.3 Effect of culture solution pH on GABA content of pumpkin seed

2.1.4 正交试验法优化南瓜籽富集GABA的培养工艺

在单因素实验的基础上，以培养温度、培养时间和培养液pH三因素进行正交试验，优化南瓜籽富集GABA的最适培养工艺，试验设计及结果见表1。

表1 南瓜籽富集GABA的培养工艺正交试验结果Table 1 The results of orthogonal test on germination process of GABA accumulation in pumpkin seed

由表1的极差分析可知，培养液pH是最主要的影响因素，培养温度次之，最后是培养时间。南瓜籽富集GABA的最适培养工艺为A3B3C1，即培养温度32℃、培养时间60 h、培养液pH5.2。在最适培养工艺下，南瓜籽中GABA含量为0.245 mg/g，是原料的3.50倍（南瓜籽原料中GABA含量测定为0.093 mg/g干重，南瓜籽吸水后含水量测定为25.1%）。

2.2 培养液组分对南瓜籽富集GABA的影响

2.2.1 CaCl2浓度对南瓜籽中GABA含量的影响

由图4可知，随着CaCl2浓度的增加，南瓜籽GABA含量呈先上升后下降的变化趋势。当CaCl2浓度为6mmol/L时，GABA富集量最高，为0.290 mg/g，比未添加（最适培养工艺）提高了18.4%。这可能是因为植物中胞质Ca2+浓度的增加会刺激GAD活性，从而促进GABA积累[17]。

2.2.2 MSG添加量对南瓜籽GABA含量的影响

由图5可知，随着培养液中MSG添加量的增加，南瓜籽中GABA含量呈先增长后下降的趋势。当MSG添加量为 8 mg/mL时，GABA 含量最高（0.308 mg/g），是未添加（最优培养工艺下）的1.26倍。可能是因为MSG作为植物GAD的专一底物，可以促进GABA的合成[15]。白青云等[12]关于马铃薯的研究也表明，马铃薯中添加MSG可以促进GABA的富集，与本研究的结果一致。

图4 CaCl2浓度对GABA含量的影响Fig.4 Effects of CaCl2concentration on GABA content

图5 MSG浓度对GABA含量的影响Fig.5 Effects of MSG concentration on GABA content

2.2.3 添加VB6对南瓜籽GABA含量的影响

图6 VB6浓度对GABA含量的影响Fig.6 Effects of VB6concentration on GABA content

培养液中添加VB6对南瓜籽中GABA含量的影响如图6（见上页）所示。GABA含量随VB6添加量的增加先增加后显著降低，当VB6为0.3 mmol/mL时，GABA含量达到最高。这可能是因为，VB6是GAD的辅基磷酸吡哆醛（PLP）的前体物质，有激活GAD达到富集GABA的作用。

2.2.4 南瓜籽富集GABA的培养液组分优化

在单因素试验的基础上，选用三因素三水平的Box-Behnken试验设计对南瓜籽富集GABA的培养液组分进行优化，试验方案和相应的实验结果见表2。

利用Design Expert软件，对表2数据进行二次多元逐步回归拟合，得到马铃薯富集GABA预测值的二次多项逐步回归方程：Y=-0.4978+0.2138X1+0.0723X2+0.2032X3+0.0085X1X2-0.0144X1X3+0.0400X2X3-0.0258X12-0.0086X22-0.8669X32。

对上述回归模型进行方差分析见表3，结果表明，回归模型的F=28.27，P=0.0001，模型显著，其决定系数R2=0.9732，说明此模型相关性良好，模型具有实践指导意义。

表2 南瓜籽富集GABA的培养液组分优化的应面实验Table 2 Response surface method on components of culture solution for GABA accumulation in pumpkin seed

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of Variance(ANOVA) for the regression model

由表3可见，CaCl2的一次项和二次项对南瓜籽GABA含量有极显著的影响（P<0.01），MSG的二次项对南瓜籽GABA含量有显著影响，VB6的一次项和二次项对南瓜籽GABA含量有显著的影响（P<0.05），其中只有CaCl2和MSG两者的交互作用对南瓜籽富集GABA的影响显著（P<0.05）。

根据回归法分析所得二次方程，在试验设定范围内，得到交互作用影响显著的两变量之间二次回归方程的响应曲面图，见图7。当VB6浓度为0.3 mmol/mL时，在固定的MSG浓度下，GABA含量随CaCl2浓度的增加呈先逐渐增加随后缓慢下降的趋势。当CaCl2浓度为5.03 mmol/L时，GABA富集量最大。当MSG浓度为7.46 mg/mL，GABA含量最高。MSG是GAD作用的底物，添加适量的MSG可以促进GABA合成，形成有效积累[14]。Ca2+是GAD的激活剂，通过与GAD碳末端的Ca2+/CaM调节区域结合而激活其活性[18]，促进GABA富集。研究报道，MSG与CaCl2的联合处理可促进马铃薯GABA含量的提高[14]，本研究结果与此报道结果一致。

根据Box-Behnken试验结果，南瓜籽富集GABA的最佳培养液组分浓度分别为CaCl25.03 mmol/L、MSG 7.46 mg/mL、VB60.28 mmol/mL，在此条件下南瓜籽富集GABA的预测值为0.357 mg/g，验证试验得出实测值为0.361 mg/g，说明预测值和实际值之间存在较高的拟合度，所建立的模型是可靠的，可以用来描述组分浓度与响应值之间的关系。以培养液组分最适浓度培养的南瓜籽GABA含量是对照（未添加各组分，0.245 mg/g）的1.47倍，是原料的5.18倍，说明优化后的培养液组分能显著提高南瓜籽中GABA含量。

图7 MSG和CaCl2的交互作用对南瓜籽GABA含量影响的响应曲面图Fig.7 Response plots for the interaction effects of MSG and CaCl2on GABA content of pumpkin seed

3 结论

采用正交试验设计优化了南瓜籽富集GABA的培养工艺，培养液pH、培养温度和培养时间对南瓜籽GABA富集有显著影响，三因素的影响顺序依次为培养液pH＞培养温度＞培养时间，最佳的发芽工艺为培养温度32℃、培养时间60 h、培养液pH5.2，此时南瓜籽中GABA的富集量为0.245 mg/g，是原料的3.50倍。采用响应面的Box-Benhnken法对南瓜籽富集GABA的培养液组分进行优化，南瓜籽GABA富集的最佳组分为CaCl2浓度 5.03 mmol/L、MSG浓度 7.46 mg/mL和 VB6浓度0.28 mmol/mL，在此条件下南瓜籽中GABA含量为0.361 mg/g，是原料的5.18倍。方差分析可知，CaCl2和VB6的一次项、CaCl2和MSG的交互作用均显著影响南瓜籽中GABA含量。