不同精粗比日粮中添加烟酸对牛瘤胃体外发酵功能的影响

杨 艳，欧阳克蕙，甘兴华，娄佑武，吴志勇，饶 辉，管业坤，余华阳，王荣民，瞿明仁*

(1.江西省农业技术推广中心，江西 南昌 330046；2.江西农业大学 动物科技学院，江西 南昌 330045)

烟酸是生物细胞辅酶I(NAD+)的合成前体,也是动物必需营养素之一；NAD(H)作为细胞生物化学过程中最重要的辅助因子之一,对碳水化合物的代谢起着重要的作用。在低营养日粮条件下,反刍动物摄入与瘤胃合成的烟酸量一般足够满足其营养需要,但随着高精料水平的提高,正常摄入的B族维生素不能满足机体对其的需要量,需要额外补充。本课题组在前期的研究表明向高精料日粮中添加烟酸可以提高育肥肉牛的生长性能和养分表观消化率,缓解高精料应激。因此,研究在高精料日粮饲喂条件下添加烟酸对瘤胃发酵功能是否具有调控作用？调控效果具体如何？以及明确在不同高精料日粮水平下能发挥瘤胃发酵功能的烟酸适宜添加量等,对阐明烟酸是否能作为高精料饲喂水平下瘤胃发酵调控的新手段,从而促进反刍动物的生产具有重要的理论和实践意义。鉴于此,本试验采用体外培养法,初步探讨了烟酸在不同比例精料底物发酵时对瘤胃发酵的调控效果,并确定了不同高精料水平下烟酸的适宜添加量。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验设3个水平的底物精粗比,分别为6∶4、7∶3、8∶2。在每个水平的精粗比底物中再设5个水平的烟酸添加量：每千克饲料(干物质)中分别添加0、400、800、1000和1200 mg烟酸。每个处理设4个重复。烟酸购自郑州兴禾化工有限公司,其有效成分含量≥97%。体外培养发酵底物的营养水平设计参照我国肉牛饲养标准(NY/T 815─2004)[1],底物配方具体见表1。将精料和稻草分别粉碎后混合,称取4 g混合物作为发酵底物，将其放入培养瓶中,再将培养液和牛瘤胃液按照1∶2的体积比例灌入培养瓶,进行24 h体外批次培养。培养后取样测定各项指标。

表1 发酵底物组成及其营养水平

1.2 试验材料

1.2.1 试验动物及饲养管理 选用3头体重270 kg±20 kg、装有永久瘤胃瘘管的锦江牛为试验动物，进行栓系饲养,饲喂基础日粮的精粗比为5∶5,稻草作为粗料。分别于每天7:00和19:00投喂日粮,并按照先粗料后精料的顺序饲喂,自由饮水。在试验开始前预饲7 d,正式采样从第8天开始,于晨饲前在瘤胃背部、中部、腹部3点采集瘤胃液，进行等量混合后供体外培养使用。

1.2.2 试验设备 参考卢德勋[2]、程茂基[3]的试验方法安装本次体外批次培养装备。

1.2.3 体外培养液的配制 A液:称取4000 mg Na2CO3、480 mg (NH4)2SO4、382.51 mg K2HPO4、292 mg KH2PO4、200 mg NaCl和100 mg MgSO4·7H2O，进行混合,然后用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。A液需于使用前1 d配制完成,放入4 ℃冰箱待用。

B液:称取500 mg EDTA、200 mg MnCl·4H2O、200 mg FeSO4·7H2O、30 mg H3BO3、10 mg ZnSO4·7H2O、20 mg CoCl2·6H2O、3 mg NaMoO4、2 mg NiCl2·6H2O和1 mg CuCl2·6H2O，进行混合,然后用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。将B液持续不断地通入18 h的CO2,封闭瓶口,放入4 ℃冰箱待用。

C液:称取25 g Na2S·9H2O,用80 mL蒸馏水溶解并定容至100 mL。向C液持续不断地通入20 min 的CO2,封闭瓶口,放入4 ℃冰箱中待用。

缓冲液:量取790.4 mL A液、8 mL B液,充分混合,通入CO218 h；于培养前1 h加入1.6 mL C液，进行充分混合，然后按照每个培养瓶40 mL的量分装到培养瓶中,并往培养瓶中持续不断通入CO210 min,最后将瓶口盖紧，安装带有三通阀(三通阀为关闭状态)的橡皮塞,将装有缓冲液的培养瓶放入恒温水浴摇床中，预热至39 ℃待用。

1.2.4 瘤胃液的采集 每天早晨在试验牛采食前,在瘤胃内不同的位置收集足量的瘤胃液,将其迅速混合，灌入已预热至39 ℃并已通满CO2的灭菌干燥培养瓶中。将装有瘤胃液的培养瓶迅速放回装有39 ℃蒸馏水的保温瓶中,迅速盖好保温瓶盖并返回试验室。将采集到的瘤胃液用4层灭菌纱布过滤，然后持续通入CO25 min,再按照每个培养瓶灌入20 mL瘤胃液的量快速分装至早已预热并装有4 g培养底物和40 mL人工培养液的培养瓶内,盖紧橡皮塞。打开注射器和培养瓶之间的三通阀,打开恒温水浴摇床的振荡开关,开始24 h的体外培养。

1.2.5 样品的预处理 体外培养24 h后，取样分析各项发酵指标。每次取样直接测定pH值，然后用低速离心机以5840 r/min的转速离心培养物15 min。离心后取上清液制样，用于测定挥发性脂肪酸(VFA)、菌体蛋白(BCP)、氨态氮(NH3-N)含量等。

1.3 测定指标和测定方法

1.3.1 产气量的测定 开始培养后,利用注射器上的刻度每间隔一定的时间记录一次产气量。记录完毕后,关闭三通阀门,放掉注射器内的气体,使其刻度归零，然后将连接有注射器的三通阀门再次打开,等待下一次产气量的记录,如此反复循环操作，直至24 h体外培养结束。

1.3.2 pH 值的测定 采用PHS-320型pH计进行测定。在测定前先用pH 4.00和pH 6.86的缓冲溶液对pH计进行校正。

1.3.3 氨态氮(NH3-N)含量的测定 离心后取一部分上清液，参考冯宗慈等[4]的比色法测定样品的NH3-N含量。

A液:用100 mL的14%水杨酸钠溶液溶解0.08 g亚硝基铁氰化钠。B液:用100 mL的0.3 mol/L NaOH溶液混合2 mL次氯酸钠溶液，然后摇匀。

制作标准曲线的方法:用0.2 mol/L的HCl溶液溶解0.382 g的氯化氨，然后定容至100 mL，作为保存液;向10 mL保存液中加入蒸馏水，稀释定容至100 mL,作为工作液，其含氮量为10 mg/100 mL;依次量取0、1、2、4、6 mL的工作液，将其分别加入到50 mL容量瓶中,再分别加入10、9、8、6、4 mL的蒸馏水,使其容量全部达到10 mL,最后用0.2 mol/L的盐酸定容，生成每100 mL中含氮量分别为0、0.2、0.4、0.8、1.2 mg的标准系列溶液;精准量取0.4 mL的标准系列溶液，分别放置于5个10 mL刻度的试管中,向不同试管中依次加入2 mL的A液和2 mL的B液,混合摇匀后静置10 min。采用0.5 cm的玻璃比色皿，在波长700 nm处进行分光光度计比色,空白对照为不含氮的0号液,记录不同含氮量标准溶液的吸光度,最后用标准溶液的含氮量与其相对应的吸光度绘制出标准曲线。

测定样品:取10 mL培养液，以3500 r/min的转速离心15 min。取离心后的上清液0.5 mL,放置于标有10 mL刻度的试管中,再向其中加入0.2 mol/L盐酸9.5 mL，使其稀释20倍,混合后摇匀。样品的比色操作同上。

原样中氨态氮含量的计算:将测得的吸光度值代入由标准曲线作出的回归方程式,得出的结果乘以样品的稀释倍数即为原样中氨态氮的含量。

1.3.4 菌体蛋白(BCP)含量的测定 参考王放[5]的比色法测定离心后上清液中的BCP含量。

1.3.5 挥发性脂肪酸(VFA)含量的测定 按照戈婷婷[6]的气相色谱法测定离心后部分上清液中的VFA含量。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析法(one-way ANOVA)对各试验组数据进行差异显著性分析,当差异显著时再进行Duncan氏多重比较。依据正交多项式分析,探讨瘤胃发酵参数随烟酸添加量变化的线性和二次方变化趋势。P<0.05表示数据差异显著,P<0.01表示数据差异极显著。

2 结果与分析

2.1 精粗比6∶4水平下烟酸对瘤胃发酵参数的影响

烟酸添加量对总产气量存在显著线性效应(P<0.05),其中对照组、400 mg/kg、800 mg/kg烟酸组的总产气量显著高于1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05)；400 mg/kg烟酸组的总产气量显著高于1000 mg/kg烟酸组的(P<0.05)；在其余各组间总产气量差异均不显著(P>0.05)。烟酸添加量对NH3-N、BCP含量无显著影响(P>0.05)。

烟酸添加量对丙酸含量存在显著的线性及二次方效应关系(P<0.05),其中400 mg/kg烟酸组的丙酸含量显著高于对照组、1000 mg/kg、1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05)；800 mg/kg烟酸组的丙酸含量显著高于1000 mg/kg、1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05)；在其余各组间丙酸含量差异不显著(P>0.05)。烟酸添加量对总VFA含量存在显著的二次方效应(P<0.05),其中400 mg/kg烟酸组的总VFA含量显著高于1200 mg/kg烟酸组的；在其余各组间总VFA含量差异均不显著(P>0.05)。烟酸添加量对乙酸、丁酸含量以及乙酸/丙酸比值无显著影响(P>0.05)。结果具体见表2。

表2 精粗比6∶4水平下添加烟酸对24 h体外培养发酵参数的影响

2.2 精粗比7∶3水平下烟酸对瘤胃发酵参数的影响

烟酸添加量对pH值存在极显著二次方效应(P<0.01),其中800、1000 mg/kg烟酸组的pH值均显著高于对照组、1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05)；在其余各组间pH值差异不显著(P>0.05)。烟酸添加量对总产气量存在极显著线性和二次方效应(P<0.01),其中800 mg/kg烟酸组的总产气量显著高于对照组、1000 mg/kg、1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05)；1200 mg/kg烟酸组的总产气量显著低于对照组、400 mg/kg、800 mg/kg、1000 mg/kg烟酸组的；在其余各组间总产气量差异均不显著(P>0.05)。烟酸添加量对NH3-N含量存在极显著线性效应(P<0.01),其中1200 mg/kg烟酸组的NH3-N含量显著高于对照组的(P<0.05)；在其余各组间NH3-N含量差异不显著(P>0.05)。烟酸添加量对BCP含量无显著影响(P>0.05)。

烟酸添加量对丙酸含量存在显著二次方效应(P<0.05),丙酸含量随烟酸添加量的增加呈先升高后降低的趋势,其中800 mg/kg烟酸组的丙酸含量显著高于1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05),但在其余各组间丙酸含量差异不显著(P>0.05)。烟酸添加量对乙酸/丙酸比值存在显著线性和二次方效应(P<0.05),乙酸/丙酸比值随烟酸添加量的增加呈先降低后升高的趋势,其中1200 mg/kg烟酸组的乙酸/丙酸比值显著高于其他各组的(P<0.05),而在其余各组间乙酸/丙酸比值差异不显著(P>0.05)。烟酸添加量对乙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸含量无显著影响(P> 0.05)。结果具体见表3。

表3 精粗比7∶3水平下添加烟酸对24 h体外培养发酵参数的影响

2.3 精粗比8∶2水平下烟酸对瘤胃发酵参数的影响

烟酸添加量对总产气量存在显著线性效应(P<0.05),总产气量随烟酸添加量的增加呈先升高后降低的趋势,其中800 mg/kg烟酸组的总产气量显著高于1000、1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05),但在其余各组间总产气量差异均不显著(P>0.05)。烟酸添加量对NH3-N含量存在显著二次方效应(P<0.05),NH3-N含量随烟酸添加量的增加呈先升高后降低的趋势,其中800 mg/kg烟酸组的NH3-N含量显著高于对照组的(P<0.05),而在其余各组间差异不显著(P>0.05)。烟酸添加量对pH值、BCP含量无显著影响(P>0.05)。

烟酸添加量对丙酸含量存在显著二次方效应(P<0.05),丙酸含量随烟酸添加量的增加呈先升高后降低的趋势,其中800 mg/kg烟酸组的丙酸含量高于其它各组并显著高于1200 mg/kg烟酸组的(P<0.05),而在其余各组间差异不显著(P>0.05)。烟酸添加量对乙酸、丁酸、总VFA含量以及乙酸/丙酸比值均无显著影响(P>0.05)。结果具体见表4。

表4 精粗比8∶2水平下添加烟酸对24 h体外培养发酵参数的影响

3 讨论

3.1 烟酸对pH值的影响

在瘤胃内合成微生物蛋白的最适宜pH值为6.0～7.0。本试验测得的各组培养液的pH值均在5.20至5.30之间,且随着精粗比提高呈现明显的降低趋势,并远低于瘤胃微生物蛋白合成的适宜pH值范围。分析其原因，在高精料底物的发酵过程中,底物中大量淀粉类饲料迅速被瘤胃微生物发酵利用,造成有机酸在短时间内大量产生,而体外培养不能完全模拟出体内的瘤胃微生物生态系统,有机酸在培养瓶中蓄积,造成培养液的pH值过低。添加烟酸对精粗比7∶3、8∶2水平下培养液的pH值有略微升高的作用,并在精粗比7∶3组添加800 mg/kg烟酸时达到了显著水平,推测烟酸通过调节酸代谢途径间接影响培养液的pH值。在精粗比6∶4水平下发酵体系中的NAD+含量可能比在精粗比7∶3、8∶2水平下充足,因此额外添加烟酸对糖酵解代谢通路的调控效果没有精粗比7∶3、8∶2明显。有研究指出，在精粗比8∶2下底物体外培养的6～18 h期间添加烟酸有显著提高pH值的效果[7]。本试验发现添加烟酸在精粗比7∶3组提高pH的效果较精粗比8∶2组明显,这可能是因为精粗比8∶2组的pH值低于精粗比7∶3组,在培养后期其抑制微生物活性的作用较精粗比7∶3强而使烟酸的调节通路受阻,造成烟酸对24 h培养液pH值的提高作用不明显。

3.2 烟酸对产气量的影响

有学者利用体外培养法通过发酵产气量测定了瘤胃有机物质的消化率,其试验结果与体内真实测定值具有非常显著的正相关关系[8]。本试验结果表明,在高精料发酵底物中添加烟酸,各试验组在24 h时的总产气量均随着烟酸添加量的增加而呈现明显的先升高后降低的趋势,其中精粗比6∶4组以添加400 mg/kg烟酸的产气量最高,精粗比7∶3、8∶2组均以添加800 mg/kg烟酸的产气量最高。推测适宜量的烟酸在一定程度上加速了饲料中碳水化合物的降解,促进了瘤胃微生物的代谢作用,使产气量增加。瘤胃内微生物在分解碳水化合物的过程中除了会产生挥发性脂肪酸(VFA)外，还会产生二氧化碳以及甲烷等气体[8]。烟酸究竟是促进了哪一种或哪几种气体的产量增加,还需进一步研究。本试验同时表明过量添加烟酸有可能会抑制瘤胃的发酵或微生物的代谢而产生负面效果。

3.3 烟酸对NH3-N含量的影响

NH3-N是瘤胃氮代谢中的重要产物,也是瘤胃微生物合成蛋白的主要氮源。瘤胃80%的细菌可以利用NH3-N作为唯一氮源合成菌体蛋白[9],即使日粮拥有完整的蛋白质,依然有大约40%的微生物蛋白是由氨代谢作用合成的[10]。在适宜的NH3-N含量范围即5～28 mg/100 mL内,瘤胃微生物蛋白合成具有较高的效率[11,12]。本试验发现,在精粗比6∶4组中NH3-N含量处于适宜氨氮含量范围,而在精粗比7∶3、8∶2组的NH3-N含量均高于这个范围,这与戈婷婷[6]的研究结果不同，这可能是因为培养底物的精粗比过高导致了体外发酵过程中氮代谢较强。有研究指出添加烟酸对NH3-N含量无显著影响,但可以稳定瘤胃NH3-N含量处于合成瘤胃微生物蛋白所需的最佳范围[13];同时也有一些研究发现添加烟酸有增加瘤胃内NH3-N含量的趋势[14],从而提高瘤胃NH3-N的利用率[15]。众多试验的结果不一致,可能与添加烟酸既可加强瘤胃微生物对日粮发酵底物的分解能力,也可提高瘤胃微生物利用NH3-N的能力有关。本试验发现，在精粗比6∶4的底物水平下,添加400～800 mg/kg的烟酸降低了发酵液中的NH3-N含量,可能是由于在精粗比6∶4的底物发酵水平下瘤胃微生物的活性强于精粗比7∶3和8∶2组的,因此添加适宜量的烟酸提高了次级发酵水平,促进了微生物合成BCP而对瘤胃NH3-N的利用。在精粗比7∶3、8∶2的底物发酵水平下添加400～1200 mg/kg烟酸提高了NH3-N的含量，可能是因为精粗比7∶3、8∶2试验组的微生物活性在培养前期较好,添加烟酸能加强微生物对发酵底物的分解能力,所以在代谢前期产生了较多NH3-N；但在24 h体外培养的后期,培养液有机酸蓄积造成pH值过低,抑制了瘤胃微生物的生长,从而降低了微生物对NH3-N的利用率,最终培养液内NH3-N含量升高。

3.4 烟酸对BCP含量的影响

瘤胃厌氧微生物以日粮中蛋白降解产生的氨、小肽和游离氨基酸为氮源,以发酵糖类产生的VFAs和CO2作为碳架,并利用生成的能量合成微生物蛋白[16]。微生物蛋白可以提供动物营养需要量的40%～80%[17]。在瘤胃内,细菌蛋白是瘤胃微生物蛋白中最为重要的组成部分,1 mL瘤胃内容物约有1010个细菌。本试验发现，在精粗比6∶4的底物中BCP含量高于精粗比7∶3、8∶2底物中BCP含量,推测精粗比6∶4底物发酵水平下的瘤胃微生物活性优于精粗比7∶3和8∶2组,所以在次级发酵中微生物利用NH3-N合成BCP的能力较精粗比7∶3和8∶2组强。本试验同时表明，添加一定量的烟酸,在24 h发酵培养液中的BCP含量均出现增加的趋势,这可能因为烟酸在促进瘤胃微生物降解日粮产生更多氨的同时也促进了瘤胃微生物利用所产生的氨合成更多的微生物蛋白。这一试验结果与许朝芳等[18]、李建国等[19]的研究结果一致。但在本试验中烟酸的添加量并不是越多效果越好,在精粗比6∶4的发酵底物水平下添加400 mg/kg,以及在精粗比7∶3、8∶2的发酵底物水平下添加800 mg/kg烟酸对增加BCP含量的效果较佳；而添加过量(即1200 mg/kg)的烟酸对BCP的合成有抑制作用,其具体作用机理有待进一步研究。

3.5 烟酸对VFAs含量的影响

VFAs是反刍动物生长发育的直接能量来源之一,反刍动物所需能量的70%～80%由VFAs提供[20],所以VFAs也是其最主要的能源。VFAs还具有贮存能量和维持正常瘤胃环境等重要功能。一般认为日粮组成对乙酸、丙酸、丁酸的比例有明显的影响。在粗饲料中由纤维素和半纤维产生的乙酸比例较高；但随着日粮精料水平的提高,瘤胃产生的丙酸、丁酸、VFA总量会增加,从而使乙酸/丙酸比值变小。本试验发现，随着发酵底物精料比例的增加,乙酸含量降低,而丙酸、丁酸、总VFA含量升高,符合上述规律。体内饲喂试验表明在日粮内添加烟酸对瘤胃乙酸、丁酸含量没有明显影响,但能提高丙酸含量[20]；也有学者发现在日粮中添加烟酸可以提高水牛乙酸、丙酸和总VFAs生成量[21]。在体外培养研究中添加400 mg/kg烟酸能使丙酸含量极显著升高,使总VFAs含量显著升高[22]。本试验结果表明：在精粗比6∶4、7∶3、8∶2的发酵底物中添加适量烟酸有增加乙酸、丙酸、总VFA含量及降低丁酸含量的趋势,说明烟酸可以调控瘤胃酸代谢类型,但在体外培养的调控效果不显著,仍需要进一步做体内验证研究。本试验结果与前人的研究结果并非完全一致，这可能是由试验动物、烟酸添加水平、日粮和环境等不同所致。本试验还发现在精粗比6∶4的底物水平下以400 mg/kg烟酸调控VFA的效果较好,在精粗比7∶3、8∶2的底物水平下以800 mg/kg烟酸调控VFA的效果较好。

4 小结

体外批次培养试验结果表明在高精料日粮水平下,添加适宜量的烟酸能提高瘤胃的pH值,增加产气量以及NH3-N、BCP、丙酸、总VFA含量,降低乙酸/丙酸比值,具有改善瘤胃发酵功能的作用。在日粮精粗比为6∶4水平下添加400 mg/kg烟酸,以及在日粮精粗比为7∶3、8∶2水平下添加800 mg/kg烟酸对体外发酵功能的调控效果较好。