ZFX在肝内胆管癌中的表达及临床意义

林 群，刘付宝，余孝俊，谢 坤，赵义军

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是原发性肝癌中的第二常见的恶性肿瘤，其发病率在世界范围内差异比较大，其中东南亚最高，西方国家发病率偏低，并且逐年上升[1-2]。ICC发生可能是一个多因素过程，缺乏明确的风险因素，长期存在的如肝内胆管结石、肝胆吸虫侵染、胆道囊肿、原发性硬化性胆管炎等被认为是ICC的诱发因素[2]。由于其发病隐匿、淋巴转移早、对放、化疗不敏感、根治性手术切除率低等特点，大部分患者治疗预后很差[3]。

X染色体耦联锌指蛋白(zinc-finger protein X-linked，ZFX)是在哺乳动物X染色体上编码的转录因子。在细胞分化、胚胎及成人干细胞的自我更新中扮演着重要角色[4]。研究表明 ZFX不仅参与干细胞的自我更新，而且在结直肠癌[5]、肝细胞癌[6]、胆囊癌[7]、肾癌[8]等多种恶性肿瘤细胞中表达升高，但ZFX在ICC中的表达及其临床意义国内外未见类似报道。该研究通过免疫组化技术检测ZFX蛋白在ICC组织中的表达水平，并和癌旁组织及肝内胆管结石组织做比较，探讨其与ICC患者临床病理学特征和预后的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料回顾性收集安徽医科大学第一附属医院肝胆胰外科2012年2月～2017年2月行手术治疗且临床病历资料完整的ICC患者的组织蜡块，共选取60例ICC肿瘤组织、50例邻近的癌旁正常胆管组织以及15例肝内胆管结石的胆管组织标本(经病理学检测为无癌组织)。60例ICC患者均无全身远处转移，术前均未进行放疗和化疗，其中男38例，女22例；年龄34～76(56.5±9.4)岁；血清糖链抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)≥37 ng/ml者34例，CA 19-9<37 ng/ml者26例；血清癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA) ≥5 ng/ml者20例，CEA<5 ng/ml者40例。TNM分期参考美国癌症联合委员会的标准，Ⅰ+Ⅱ期45例，Ⅲ+Ⅳ期15例。肿瘤低分化者29例，中高分化者31例。根据术前检查、术中所见及术后淋巴结病理检查，有淋巴结转移者11例，无淋巴结转移者49例。

1.2 主要试剂兔抗人ZFX多克隆抗体(bs-12306R，稀释度1 ∶200)购自北京博奥森生物公司；PV-9001检测试剂盒(兔二步法检测试剂盒)及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法应用免疫组化方法检测ICC组织、癌旁组织及正常肝内胆管结石组织中ZFX蛋白的表达。将病理科收集所得病例的石蜡包埋组织制作成厚度4 μm的切片。将所有的石蜡切片放入90 ℃的烤箱中烤片20 min，经二甲苯溶液浸泡3次各10 min脱蜡，在依次不同浓度乙醇(100%、95%、75%)溶液各5 min，蒸馏水水化，适量的内源性过氧化物酶阻断剂孵育10 min，抗原修复采用柠檬酸微波高火加热10 min，加热后冷却1 min，在加热1 min，反复5次，然后室温自然冷却30 min，孵育一抗兔抗人ZFX抗体4 ℃过夜，PBS洗3次，滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物室温20 min，PBS洗3次后DAB显色，显微镜下控制，苏木精复染，脱水，封片，最后镜检采集数据。用PBS代替一抗作为阴性对照。

图1 胆管组织中ZFX的表达 PV×200

1.4 结果判定染色结果评估由对临床病理资料不知情的两位病理科医师进行。应用普通光学显微镜在高倍镜(×200)下随机挑选5个视野，观察阳性细胞染色程度和阳性细胞百分比，并进行评分。染色强度评分从0到3，依次为0(阴性，无色)，1(弱，浅黄色)，2(中，棕黄色)和3(强，棕褐色)； 阳性细胞百分比评分从0到4，依次为0(<5%)、1(≥5%～25%)、2(>25%～50%)、3(> 50%～75%)和4(>75%)。最终结果为两项评分相加，总分≥ 3分认为是高表达，<3分认为是低表达[5]。

1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行分析。计数资料采用χ2检验，癌、癌旁及肝内胆管结石组织的ZFX表达比较采用配对t检验；采用Kaplan-Meier方法绘制ZFX高表达和低表达患者的生存曲线，并用Cox回归分析模型确定ICC患者预后的独立影响因素，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZFX蛋白在三种组织中的表达免疫组化染色(PV-9001兔二步法检测试剂盒)检测三种组织中ZFX的表达，镜下观察可见ZFX蛋白表达主要定位在细胞核内，部分细胞质内可见表达，呈棕黄色染色颗粒，见图1。结果表明ZFX蛋白在ICC组织、癌旁组织及肝内胆管结石组织中高表达率差异有统计学意义(χ2=18.662，P<0.001)，且肿瘤组织中的高表达率明显高于癌旁组织(χ2=13.914，P<0.001)和正常肝内胆管结石组织(χ2=11.343，P=0.001)，差异有统计学意义，见表1。

2.2 ICC组织中ZFX蛋白表达与其临床病理特征的关系ICC组织中ZFX的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、血清CA19-9、有无脉管癌栓差异无统计学意义(P>0.05)；在血清 CEA升高、肿瘤分化程度低、有淋巴结转移、 TNM分期高的患者ICC组织中ZFX高表达率较高，且在血清CEA、肿瘤分化程度的表达差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 三种胆管组织中ZFX的表达[n(%)]

表2 ZFX表达与ICC患者临床病理特征的关系分析[n(%)]

2.3 ZFX蛋白表达与ICC生存预后的关系将有完整随访资料的46例ICC患者分为高表达组(31例)和低表达组(15例)，总体随访时间2～40个月，中位随访时间为12个月。结合免疫组化的结果，分析两组总体生存率的差异，生存曲线见图2，结果显示ZFX高表达患者总体生存率明显低于ZFX低表达患者，差异有统计学意义(P=0.006)。单因素Kaplan-Meier总体生存率分析结果表明淋巴结转移、TNM分期以及ZFX表达与ICC患者预后显著相关(P<0.05)，多因素Cox回归模型分析结果表明ZFX表达是ICC患者不良预后的独立影响因素(HR=2.635, 95%CI：1.044～6.651,P=0.040)，见表3。

图2 ZFX高表达与低表达患者的生存曲线

因素HR95% CIP值单因素 年龄(≥60岁vs<60岁)1.0300.987～1.0740.173 性别(男vs女)1.1270.540～2.3530.750 肿瘤分化(中高分化vs低分化)1.1980.592～2.4240.616 淋巴结转移(有vs无)2.7561.242～6.1150.013 TNM分期(Ⅰ/Ⅱ vs Ⅲ/Ⅳ)2.1491.025～4.5050.043 CA19-9(≥37 U/ml vs <37 U/ml)1.7410.816～3.7150.151 CEA(≥5 μl/L vs <5 μl/L)1.9130.925～3.9550.080 ZFX(高表达vs低表达)3.1651.290～7.7650.012多因素 淋巴结转移(有vs无)2.0450.425～9.8330.372 TNM分期(Ⅰ/Ⅱ vs Ⅲ/Ⅳ)1.0630.246～4.5870.934 CEA(≥5 μl/L vs <5 μl/L)1.4640.695～3.0860.316 ZFX(高表达 vs 低表达)2.6351.044～6.6510.040

3 讨论

ZFX属于锌指蛋白家族，由X染色体编码，全长蛋白含有酸性转录激活域，核定位序列和由13 C2H2型锌指组成的DNA结合域。研究[4,9]表明ZFX为胚胎干细胞和成人造血干细胞的共同转录调节因子，在胚胎和成人干细胞自我更新中发挥重要作用。另外对于成人造血干细胞功能长期稳定的维护，一定功能水平的ZFX是必须的。许多研究[10]表明ZFX不仅参与干细胞的自我更新，而且与多种恶性肿瘤的发生相关，可以促进肿瘤的增殖、转移，影响癌症患者预后。Weng et al[7]研究表明在胆囊癌组织中经常检测到ZFX蛋白过表达，ZFX的表达与侵袭性临床病理学显著相关，并且导致胆囊癌患者的预后显著较差，进一步通过体外细胞功能实验，敲低ZFX的表达能显著抑制胆囊癌细胞侵袭、增殖和转移。Wu et al[11]研究证实了敲低ZFX基因的表达可通过下调细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶通路在体外和体内抑制胃癌细胞增殖。

本研究通过免疫组化检测60例ICC组织中ZFX的表达水平，结果显示癌组织中ZFX表达明显高于邻近的癌旁组织(P<0.05)及肝内胆管结石组织(P<0.05)，这表明ZFX可能在ICC的发病机制中起重要作用。然后继续分析ZFX表达与患者临床病理特征的相关性，结果显示在肿瘤组织分化低、TNM分期高、有淋巴结转移及血清CEA升高的患者癌组织中ZFX高表达率较高。因此推测ZFX可能参与ICC的发生，过表达的ZFX可能促进肿瘤细胞的侵袭和转移。这也为肿瘤分子靶向治疗提供新的作用位点。

在随访资料中，对ZFX基因表达水平与ICC患者的临床预后意义进行研究，结果表明ZFX的表达与ICC生存预后显著相关，高表达ZFX的ICC患者术后总体生存率较低。单因素生存分析结果表明有无淋巴结转移、TNM不同分期以及ZFX表达高与低的ICC患者其生存时间差异有统计学意义，多因素Cox回归模型分析结果表明ZFX可作为预测ICC患者预后不良的独立因素，这一结果与ZFX在其他肿瘤中的随访结果类似。Li et al[8]报道了53例肾癌的临床随访研究，结果表明ZFX预测较差的预后，可作为预后指标。Li et al[12]研究显示ZFX可作为鼻咽癌患者的有效预后生物标志物，而且还表明针对ZFX的靶向治疗可能是预防鼻咽癌进展和转移的新型治疗策略。

综上所述，ZFX在ICC中常常表现为高表达，ZFX的表达可能参与肝内胆管的发生发展。高表达的ZFX与肿瘤恶性病理特征相关，是ICC不良预后的独立因子。因此，ZFX可能成为ICC的潜在新型生物治疗靶点，但具体的分子作用机制仍需进一步探索。