miR-200a通过调控HIF-1α与VEGF通路调节鼻息肉上皮细胞增殖及凋亡作用研究

雍 军，哈再古丽·贾汉，李林格，张 华，冯 娟，赵 琦，尼力帕尔·阿力木

鼻息肉(nasal polyps，NP)是在鼻腔中形成的一种良性肿物，尽管不是致命性疾病，可是发病率极高，表现出的症状为头痛、鼻塞等，能够对患者的生活与工作造成严重困扰[1-2]。这几年，研究[3]显示，鼻息肉是不同细胞因子共同参与、具有延续性的炎症反应产物，通过在患者鼻腔内使用糖皮质激素，能够减少分泌的炎性细胞因子；其中鼻息肉上皮细胞不断增殖，对组织损伤进行修复，确保上皮细胞保持完整的屏障结构，并且让鼻息肉组织的环境保持稳态[4-5]。微小RNA(microRNA，miR)作为一类新型基因调控分子，与鼻息肉的发生发展密切相关。微小RNA(miR)-200 家族包括5个成员，即miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c以及miR-429，其中，miR-200a在1号染色体，当miR-200a过度表达会让恶性肿瘤细胞得到侵袭能力，然而miR-200a在鼻息肉中的功能和作用机制不是很确定[6-8]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是在牛垂体形状细胞体外细胞培养分离并纯化的糖蛋白，能够增强内皮细胞具有的分裂增生能力，还可以提升毛细血管通透性[9]。低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是哺乳动物和人体内的核转录因子，HIF-1α在肿瘤细胞中可获得大量表达，可以激活PI3K/AKT/FRAP途径，从而调整细胞增殖与凋亡[10]。该研究采取多种分子生物学方法，探讨了miR-200a通过调控HIF-1α与VEGF通路调节鼻息肉上皮细胞的增殖及凋亡作用，从而揭示miR-200a在鼻息肉中的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂通过伦理审核，取人体鼻息肉上皮CNE细胞经伦理审核备案，鼻息肉上皮CNE细胞来源于新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科鼻息肉手术患者，培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，培养条件为37 ℃、5% CO2的孵箱；miR-200a模拟物和对照模拟物购自美国Ambion 公司；ECL系统购自美国Syngene公司；兔抗人β-actin单克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人HIF-1α、VEGF单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；脂质体转染试剂购自美国Invitrogen公司；MTT检测试剂盒购自美国Sigma 公司。

1.2 细胞增殖实验CNE细胞分为3组，实验组与对照组选用脂质体转染试剂将CNE细胞瞬间转染miR-200a模拟物、对照模拟物，空白组不转染任何试剂，采用PCR检测仪验证其转染的效率。把已转染的细胞株分别接种在密度为5 000个/孔的真空培养板，经过48 h培养，使用MTT试剂盒对细胞的增殖性进行测定，每个实验均重复接种至3个孔。

1.3 细胞凋亡实验使用Tunel试验进行细胞凋亡检测，这是原位细胞凋亡检测技术，可以利用DAB显色来表达凋亡细胞，并结合光学显微镜来检测凋亡细胞。CNE细胞经过96孔48 h培养，吸取培养液，以4 ℃、1 000 r/min离心10 min，将沉淀取出，添加PBS重悬，再离心后提取，加入300 μl凋亡检测缓冲液，以单个象限的细胞数对细胞凋亡率进行测算，每个实验均重复接种至3个孔。

1.4 Western blot实验在miR-200a转染48 h后，提取细胞总蛋白，以BCA法检测蛋白浓度，接着分离蛋白，将其转移到PVDF膜，封闭并添加一抗β-actin、HIF-1α、VEGF，4 ℃过夜。通过TBST对膜进行30 min清洗，添加二抗在室温下孵育1 h，再次用TBST洗膜30 min，添加ECL发光剂，最后使用电脑对发光进行扫描。

2 结果

2.1 3组转染效果、细胞增殖和细胞凋亡情况比较qRT-PCR检测结果显示，miR-200a转染后，实验组与对照组及空白组比较，miR-200a的表达水平升高37.82倍，表明miRNAs mimics转染成功；转染48 h，实验组的活细胞比例显著低于对照组与空白组，细胞凋亡率显著高于对照组与空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 HIF-1α与VEGF表达对比转染48 h后Western blot检测显示，实验组的HIF-1α与VEGF表达水平均显著高于对照组与空白组(P<0.05)。见图1、2和表2。

图1 HIF-1α蛋白的表达情况对比1：实验组；2：对照组；3：空白组

图2 VEGF蛋白的表达情况对比1：实验组；2：对照组；3：空白组

3 讨论

在临床上，鼻息肉是发病率极高的炎性疾病，属于非瘤样肿物，一般是从筛骨脱落进入鼻腔，进而阻塞鼻腔，以及副鼻窦出现引流障碍[11]。其病理特征是水肿基质中出现大量炎性细胞浸润，绝大多数鼻息肉主要为嗜酸性粒细胞，当前发病机制尚不确定，学术界普遍认同多因素发病这一观点[12]。研究者总结出鼻息肉的主要形成过程：受各因素影响，鼻黏膜上皮发生断裂，使得纤维组织脱离；脱离的纤维组织出现表面皮化，进而形成小息肉；随后小息肉形成了中腺体；息肉进一步增生以及增长，最后完全形成息肉。在鼻息肉形成及发展方面，上皮细胞发挥关键作用，通过持续增殖，从而修复组织损伤，使上皮细胞的屏障结构保持完整，并且让鼻息肉组织的环境保持稳态。而且，上皮细胞效应进一步发展，还会导致上皮细胞对调节功能具有免疫作用，这种免疫作用跟炎症的刺激时间存在一定关联[13]。

表1 3组转染效果、细胞增殖和细胞凋亡情况比较

与空白组比较：*P<0.05；与对照组比较：#P<0.05

表2 3组HIF-1α与VEGF蛋白相对表达量对比

与空白组比较：*P<0.05；与对照组比较：#P<0.05

microRNA是内源基因编码的非编码小分子RNA，长度约22个核苷酸，通过跟靶mRNA的3′-UTR、编码区部分配对或完全配对，对蛋白质翻译进行抑制，或使mRNA降解，经过转录，负向调控的靶基因表达。现代研究[14]表明miRNA与疾病发生和发展关系密切，特异的miRNA表达谱可作为疾病预防和诊断的标志物。miR-200家族在上皮细胞的形成过程中发挥重要作用，miR-200家族成员可以抑制上皮细胞形成过程，可抑制E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达。本研究显示，在转染48 h后，实验组的活细胞显著低于对照组与空白组；细胞凋亡率方面，实验组和对照组以及空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，这说明miR-200a的表达水平与鼻息肉细胞增殖能力呈负相关性，与凋亡能力呈正相关性，表明miR-200a可能参与鼻息肉细胞的调控。

在鼻息肉组织当中，上皮基底细胞存在多向分化的潜能，属于多能干细胞。Fas-L在鼻息肉上皮基底细胞中表现为过度表达，而鼻息肉组织当中，淋巴细胞主要为T细胞[15]。HIF-1由α亚单位和β亚单位组成，α亚单位受氧调控，具有特异性，对HIF-1活性有着决定性作用。当癌基因激活时或抑癌基因失活时，肿瘤细胞中的HIF-1α活性就会升高。并且PI3K/AKT可因PTEN的负调控作用丧失而呈现高活化状态，从而诱导HIF-1表达上调[16]。VEGF是一种同型二聚体糖蛋白，广泛分布于人的脑、眼、血浆、腹腔、肾、脾、肝、肺等组织中，对维持血管的正常形态和功能有积极作用。VEGF与受体结合能够对内皮细胞的生长及增殖起到诱导作用，有利于内皮细胞的迁移，促使新生血管产生[17]。本研究中，转染48 h后，Western blot检测显示，实验组HIF-1α和VEGF表达水平比对照组和空白组明显降低(P<0.05)。表明miR-200a有可能在HIF-1α/VEGF信号转导通路中发挥作用，进而对鼻息肉的凋亡和增殖产生影响。下一步需通过验证miR-200a下游靶基因，继续阐明miR-200a参与鼻息肉细胞增殖与凋亡的分子机制，为开发新的治疗手段和方法提供理论基础和实验依据。

综上所述，miR-200a可通过激活HIF-1α与VEGF通路，对鼻息肉上皮细胞的增殖能力加以限制，使凋亡能力得到提升，进而影响鼻息肉细胞生物行为。