PGE2/PGE2-R介导的RAS/ERK及PI3K/AKT信号途径与子宫肌瘤发病机制的研究

柯小平， 李经维,2 ，李 莉,2 ，刘茗敏

前列腺素是花生四烯酸的代谢产物，PGE2(prostaglandin E2)是环氧合酶促进花生四烯酸代谢所形成的产物[1]。PGE2受体分为EP1、EP2、EP3和EP4四种亚型，介导不同的PGE2依赖性生物学效应[2]。PGE2可与跨膜G蛋白偶联的受体EPs相互作用，并激活或阻断胞内第二信使。研究[3]证实，子宫肌肉中会有EP1受体的表达，通过提高胞内钙离子浓度和激活蛋白激酶C而发挥作用。研究[4]表明，子宫肌瘤的发生发展与多种生长因子有关，其中包括表皮生长因子、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和血小板生长因子等，这些生长因子会促进肌瘤细胞的有丝分裂及生长，其中IGF-1具有刺激子宫肌层增生功能的调节因子。活化G蛋白是G蛋白偶联受体受体信号转导的第一步，其中最主要的信号通路为PI3K/AKT和Ras-Raf-ERK信号通路[5]。在PI3K/AKT信号通路中，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)作为细胞内的第二信使[6]。丝/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)是PI3K信号转导途径中的一个重要的下游靶激酶。PI3K/AKT信号通路参与细胞生长、增殖、分化信号调节[7]。在Ras-Raf-ERK信号通路中，生长因子与受体结合后激活酪氨酸激酶并传递给Ras蛋白，Ras-GTP直接与Raf相结合激活[8]。细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)包括ERK1和ERK2，与细胞的增殖分化密切相关[9]。RAS/ERK及PI3K/AKT信号级联传导，参与调控细胞周期启动、增殖或凋亡效应[10]。

该研究旨在探究PGE2及其受体介导的RAS/ERK和PI3K/AKT两条细胞增殖信号途径在子宫肌瘤发病机制方面的作用。收集子宫肌瘤和其邻近正常平滑肌组织，Real-time PCR检测PEG2-R(EP1)的表达，Western blot检测PGE2和PGE2-R的表达；经PGE2-R激动剂或抑制剂预处理的子宫肌瘤细胞后，测定细胞的增殖效应，并采用Real-time PCR及Western blot检测PGE2/PGE2-R介导的RAS/ERK途径中和PI3K/AKT途径信号分子Ras、ERK、PI3k、AKT、IGF-1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等指标。探究PGE2/PGE2R介导的子宫肌瘤增殖信号及增殖效应，为子发病机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 病例资料选择2014年1月～2015年1月同济大学附属杨浦医院收治的腹腔镜下行子宫肌瘤切除术的30例患者，年龄30～52(40.66±5.78)岁，近6个月内未服用激素类药物。子宫肌瘤和平滑肌经病理学确诊，无其他并发症。选取手术切除的肌瘤组织为实验组，肌瘤附近0.5 cm的子宫平滑肌组织(视为健康组)为对照组。经过患者同意和本院伦理委员会批准。所收集组织一部分保存于液氮中用于后续蛋白提取和RNA抽提，另一部分剪成小片，用于细胞培养。

1.2实验试剂CCK-8试剂盒购自美国SAB公司，货号CP002；SYBR Green PCR试剂盒购自美国Thermo公司，货号#K0223；逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，货号#K1622；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司，货号PICPI23223；RIPA组织细胞快速裂解液购自北京Solarbio公司，货号R0010；PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2抗体和二抗均购自美国CST公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1实验分组及给药 液氮中子宫肌瘤组织和邻近平滑肌组织取出，RT-PCR检测30对样本PGE2-R(EP1)的表达，Western blot检测PGE2和PGE2-R(EP1)的表达。培养子宫肌瘤原代细胞，同时加入PGE2-R(EP1受体)抑制剂sc-51322或激动剂17-PT-PGE2，分为原代细胞组、原代+sc-51322组和原代+17-PT-PGE2组。

1.3.2细胞培养 子宫肌瘤组织置于1%双抗(青链霉素混合液)的HBSS中；0.4%胶原酶8 ml(内含DNase I)，37 ℃摇床消化；消化结束后后用含10%的DMEM-F12重悬细胞，置细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育培养。每隔20 min将没有贴壁的细胞转移到新的培养瓶中，重复3次，第1次贴下来的即为平滑肌细胞，经过3次贴壁仍未贴壁的细胞即为平滑肌细胞。此贴壁法是根据时间差采用的对成纤维细胞和平滑肌细胞进行的分离。24 h后健康细胞均已贴壁；48 h后贴壁细胞形成小的克隆。鉴定子宫平滑肌细胞的标准采用α-actin免疫组化染色，培养子宫肌瘤细胞同平滑肌细胞。

1.3.3CCK-8检测子宫肌瘤原代细胞的增殖活性 将处于对数生长期的子宫肌瘤原代细胞经胰蛋白酶消化，显微镜下计数后制成3×104个/ml的细胞悬液。分别取100 μl至96孔培养板，每组细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，3×103个细胞/孔，以100 μl培养液做空白对照，37 ℃培养过夜。实验分组如下：① 原代细胞：100 μl完全培养基正常培养；② 原代细胞+sc-51322：加入终浓度为10 μmol/L sc-51322(PGE2-R抑制剂)；③ 原代细胞+17-PT-PGE2：加入终浓度为5 μmol/L 17-PT-PGE2 (PGE2-R激动剂)。分别在共培养0、24、48、72 h后，按1 ∶10体积比混合细胞计数试剂盒(CCK-8)和无血清必需基本培养基，每孔400 μl 加入待测孔中，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育1 h；孵育1 h后，用酶标仪测定450 nm波长吸光度(absorbance,A)值，并记录每块板的数值。

1.3.4Real-time PCR 取子宫肌瘤组织和平滑肌组织各10 mg，TRIzol提取总RNA，将RNA逆转录程cDNA。设计PGE2-R引物：上游引物：5′-CACCTTCTTTGGCGGCTCTC -3′；下游引物：5′-CGACACCACCATGATACCGA-3′,扩增片段长度100 bp。以GAPDH为内参照，上游引物：5′-AATCCCATCACCATCTTC-3′；下游引物： 5′- AGGCTGTTGTCATACTTC-3′，扩增片段长度218 bp。PCR反应总体积25 μl，反应程序：95 ℃，10 min(95 ℃，15 s；60 ℃，45 s)×40；95 ℃,15 s；60 ℃,1 min；95 ℃,15 s；60 ℃,15 s。数据采用仪器自带软件分析(ABI Prism 7300 SDS 软件)。

1.3.5Western blot实验 将需要抽提蛋白的细胞或组织，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，4 ℃充分裂解细胞，95 ℃以上加热10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃ 冰箱。使用BCA蛋白浓度试剂盒对蛋白浓度进行定量。

选取5%的浓缩胶和10%的分离胶，取20 μl蛋白样品进行上样，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。丽春红染色检测转膜成功。使用10%的脱脂乳粉溶液进行封闭2 h后，加入稀释的一抗：PGE2 1 ∶300，PGE2-R 1 ∶500，PCNA 1 ∶1 000，TGF-β 1 ∶300，IGF-1 1 ∶2 000，AKT 1 ∶1 000，p-AKT 1 ∶1 000，p-ERK1/2 1 ∶1 000，ERK1/2 1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶2 000。孵育一抗的膜用TBST洗3次，每次15 min，按照1 ∶1 000稀释标记的二抗与膜37 ℃孵育2 h。用TBST洗涤3次，每次5 min。使用化学发光法对蛋白进行显色。

2 结果

2.1 RT-PCR检测30对子宫肌瘤患者和健康临床样本的PGE2-R(EP1)表达RT-PCR检测30对子宫肌瘤和子宫平滑肌的结果显示，子宫肌瘤组织的PEG2-R(EP1) mRNA的表达量为(0.004 67±0.001 37)，子宫平滑肌组织的表达量(0.001 69±0.004 64)。结果显示：子宫肌瘤组PGE2-R(EP1)的mRNA表达量显著高于子宫平滑肌组(P<0.01)。子宫肌瘤的发生会导致PGE2受体的基因表达量升高。

2.2 Western blot检测4对样本PGE2和PGE2-R(EP1)的表达如图1和表1所示，Western blot检测4对样本PGE2和PGE2-R(EP1)的结果表明，子宫肌瘤组织的PGE2和PGE2-R(EP1)的蛋白表达量均显著高于子宫平滑肌组织(P<0.01)，这与基因的检测结果相一致。

2.3 CCK-8检测子宫肌瘤原代细胞的增殖活性如表2所示，CCK8结果显示，与原代细胞组比较，随着培养时间的延长，原代+sc-51322组中的细胞增殖显著受到抑制(P<0.01)，而原代+17-PT-PGE2组中的细胞的增殖活性显著增加(P<0.01)，并且在培养72 h后，sc-51322对细胞增殖的抑制及17-PT-PGE2对细胞增殖的促进均达到最大值，说明子宫肌瘤原代细胞的增殖与PGE2-R的表达密切相关。

图1 Western blot检测4对样本PGE2和PGE2-R(EP1)的表达

1：子宫平滑肌组1；2：子宫平滑肌组2；3：子宫平滑肌组3；4：子宫平滑肌组4；5：子宫肌瘤组1；6：子宫肌瘤组2；7：子宫肌瘤组3；8：子宫肌瘤组4

表1 Western blot检测4对样本PGE2和PGE2-R(EP1)的表达

与子宫平滑肌组比较：**P<0.01

2.4 RT-PCR检测子宫肌瘤原代细胞的PCNA、TGF-β、IGF-1基因表达如表3所示，RT-PCR检测PCNA、TGF-β、IGF-1的表达结果显示，原代+sc-51322组中的细胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表达量显著低于原代细胞组，原代+17-PT-PGE2组中的细胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表达量显著高于原代细胞组。以上结果说明子宫肌瘤原代细胞中PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA表达量受到PGE2-R的调控，并会随着PGE2-R含量的增加而上调。

2.5 Western blot检测子宫肌瘤原代细胞相关蛋白的表达如图2和表4所示，Western blot检测细胞中相关蛋白的结果显示，原代+sc-51322组中的细胞PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表达量均显著低于原代细胞组，原代+17-PT-PGE2组中的细胞PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表达量均显著高于原代细胞组，说明子宫肌瘤原代细胞中RAS/ERK及PI3K/AKT信号途径受到PGE2及其受体PGE2-R(EP1)的调控。

表2 CCK-8检测子宫肌瘤原代细胞的增殖活性

与原代细胞组比较：*P<0.05，**P<0.01

表3 RT-PCR检测子宫肌瘤各组细胞PCNA、TGF-β、IGF-1基因表达

与原代细胞组比较：**P<0.01

图2 Western blot检测子宫肌瘤各组细胞中相关蛋白的表达

A：子宫肌瘤原代细胞；B：原代+sc-51322细胞；C：原代+17-PT-PGE2细胞

表4 Western blot检测各组细胞中PGE2、PGE2-R(EP1)、PCNA、TGF-β、IGF-1、p-AKT、p-ERK1/2的表达

与原代细胞组比较：**P<0.01

3 讨论

目前，对于子宫肌瘤的病因尚不清楚，推测其可能与卵巢内分泌功能、孕激素受体、孕激素、生长因子等因素相关[11]。本研究通过收集子宫肌瘤和正常子宫平滑肌组织，结果显示子宫肌瘤的PGE2-R(EP1)的mRNA表达量和蛋白表达量均显著高于正常平滑肌组织(P<0.01)。这说明子宫肌瘤的发病与组织中PGE2和PGE2-R(EP1)的基因和蛋白的含量有关联，推测组织中PGE2和PGE2-R(EP1)的上调会促使子宫肌瘤的发生与发展。

研究[12]表明，子宫肌瘤的发生发展与多种生长因子有关，其中包括TGF-β、IGF-1和PCNA等，这些生长因子会促进肌瘤细胞的有丝分裂及生长，其中IGF-1的促进功能最为显著。本研究以子宫肌瘤原代细胞为靶细胞，加入PGE2-R(EP1受体)抑制剂sc-51322或激动剂17-PT-PGE2，测定了细胞的增殖活性以及PCNA、TGF-β、IGF-1的基因和蛋白表达情况。本研究中，与原代细胞组比较，原代+sc-51322组中的细胞增殖显著受到抑制(P<0.01)，说明抑制剂sc-51322的加入，抑制了PGE2-R(EP1受体)的表达，从而抑制了子宫肌瘤原代细胞的增殖活性。同时，本研究还显示，原代+17-PT-PGE2组中的细胞的增殖活性显著高于原代细胞组，说明激动剂17-PT-PGE2的加入激活了PGE2-R(EP1受体)的表达，从而增强了子宫肌瘤原代细胞的增殖活性。为了探究PGE2-R(EP1受体)的表达与相关生长因子分泌的关系，本研究测定了PCNA、TGF-β、IGF-1的基因及蛋白表达，结果显示，原代+sc-51322组中的细胞PCNA、TGF-β、IGF-1的mRNA和蛋白表达量显著低于原代细胞组，而原代+17-PT-PGE2组中的蛋白的表达量显著高于原代细胞组。以上结果说明，子宫肌瘤细胞中PGE2-R(EP1受体)的表达与相关的生长因子的分泌呈正相关性。本研究同时显示，子宫肌瘤组织中p-AKT和p-ERK1/2均过度表达，且p-AKT和p-ERK1/2的表达与PGE2-R(EP1受体)的调控密切相关，证实PGE2-R(EP1受体)参与了子宫肌瘤的发生与发展。

体内和体外实验证实，PGE2和PGE2-R(EP1)参与调控了子宫肌瘤的发生与发展，并且参与调控子宫肌瘤原代细胞中RAS/ERK及PI3K/AKT信号途径，为子宫肌瘤的发病机制提供了可靠的理论依据。