L-苯丙氨酸对苹果醋发酵乙酸-2-苯乙酯合成途径的影响

宋 娟，张霁红，康三江*，张海燕，曾朝珍，袁 晶，张 芳，黄玉龙

（甘肃省农业科学院 农产品贮藏加工研究所，甘肃 兰州 730070）

苹果醋是以苹果汁或渣作为原料，经过酒精发酵和醋酸发酵后获得[1]，再加以调制成有独特苹果香气的醋饮料[2-3]。由于苹果品种差异、菌种老化、加工工艺单一等原因，导致追求苹果醋制品多样化的同时，却引起果醋香气等品质的下降。

L-苯丙氨酸是一种符合现代食品工业绿色安全标准的食品添加剂[4-5]，主要是微生物通过从头合成途径和艾氏途径将L-苯丙氨酸转化为β-苯乙醇[6]。许多发酵产品在发酵过程中由微生物自然形成具有风味和香气的酯类化合物，大多数酵母菌能产生杂醇油，而β-苯乙醇是杂醇油的重要组成部分，具有玫瑰香味；乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是醋酸发酵的关键酶，该酶是膜结合蛋白，与醋酸菌的膜结合影响醋酸菌的乙醇转化率和醋酸菌的产酸率[7]；乙酸-2-苯乙酯是酵母菌发酵产品的主要的特征性香气成分，具有甜蜜香味[8-9]，已有研究发现其合成途径有两条[10-12]：（1）在酯酶（esterase）的作用下由乙酸和β-苯乙醇合成；（2）在醇酰基转移酶（alcohl acyltransferaes，AAT）的作用下由乙酰辅酶A和β-苯乙醇形成。目前，国内外学者主要采用不同处理方式如超声[13]、微波[14]，调控氮源浓度[15]，不同特性的酵母菌种共发酵[16]，生物酶解技术[17]等方法提高乙酸苯乙酯等酯类物质的含量。在红曲黄酒酿造中发现乙酸-2-苯乙酯是在后续发酵过程中酵母通过酯合成[18]，主要是酯酶合成途径[19]；苹果酒酵母代谢中乙酸苯乙酯主要由AAT催化合成[10]，且AAT对乙酸苯乙酯的合成具有特异性[20]，STRIBNY J等[21]也同样提出葡萄酒酿造中AAT具有底物特异性。然而，在苹果醋发酵过程中，L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯及其关键酶活的影响还未见相关研究。

本试验在该课题前期研究[22-23]的基础上，采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），初步分析食品添加剂L-苯丙氨酸对苹果醋中合成乙酸-2-苯乙酯及其相关基质和关键酶活的影响，为苹果醋制品香气成分和风味物质的代谢调控提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

苹果（“长富二号”红富士）：甘肃庆阳。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1750、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）CICC20056：中国工业微生物菌种中心。

1.1.2 培养基[24]

基础培养基：10 g/L葡萄糖，10 g/L酵母粉，pH 4.5。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉。

转化培养基：60g/L葡萄糖，6g/L蛋白胨，0.5g/LMgSO4，5 g/LKH2PO4，分别添加0、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的L-苯丙氨酸，自然pH值。上述培养基灭菌条件均为121℃灭菌20 min。

1.1.3 化学试剂

氢氧化钠（粒）、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、琼脂、无水乙醇、碳酸钙、MgSO4、KH2PO4（均为分析纯及生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；果胶酶（＞50 000 U/g）：上海源聚生物科技有限公司；乙酸、乙醇、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-辛醇（色谱纯）（67.396 mg/L）：美国Sigma公司；L-苯丙氨酸（98.5%）：上海生工生物公司股份有限公司；乙酰辅酶A/ADH/AAT/Esterase ELISA试剂盒：北京冬歌生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA224S-CW电子天平：上海赛多利斯贸易有限公司；YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；ZHJH-C1112B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；PZJ-0.5型榨汁机：江苏科威机械有限公司；LRH-250生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；TRACE 1310-ISQ-LT气相色谱-质谱联用仪、三重四级杆气质联用仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；Synergy H1酶标仪：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

吸取0.5 mL基础培养基溶解菌粉，菌悬液转移至盛有5 mL液体培养基的试管中，24℃（CICC1750）/28℃（CICC 20056）恒温培养；划线制备活化的酵母菌，按8%接种于转化培养基，120 r/min、24 ℃培养48 h，备用。

1.3.2 苹果醋加工工艺流程

富士苹果→挑选、清洗、榨汁→苹果汁、渣分离→果胶酶处理苹果汁→接种酵母菌液（酒精发酵）→接种醋酸菌（醋酸发酵）→陈酿→苹果醋

操作要点：采用0.8%果胶酶（酶活＞50000U/g）处理苹果汁（降低果汁黏稠度，提高出汁率和澄清度）；接种8%CICC1750酵母菌液，24℃条件下酒精发酵，当酒精体积分数不增加、糖度不降低时结束酒精发酵；接种10%CICC20056醋酸菌液，28℃条件下醋酸发酵，当醋酸浓度不再升高时结束醋酸发酵。将醋酸发酵后的苹果醋放入密闭容器中，控制温度在18～25℃之间，静置3个月以上完成陈酿过程。

1.3.3 测定方法

（1）挥发性物质的测定[25-26]

顶空固相微萃取法：样品前处理采用SPME法处理，分别取5 mL样品加入50 μL 3-辛醇内标，漩涡混匀，装入15 mL顶空瓶中，样品由TriPlus RSH Autosampler-SPME系统处理，萃取头：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头。萃取条件：60.0℃吸附40 min。保温5 min。外标标准品母液1 000 mg/L，100 mL纯乙醇＋0.1 g外标（乙酸、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯），外标测试样品准备A液10 mL（体积分数4%乙醇溶液）＋10 μL待测母液，样品瓶5 mL＋50 μL 3-辛醇内标。

气相色谱（GC）条件：进样口温度25℃，载气氦气（He），流速1.2 mL/min。进样量1 μL，分流进样，分流比40∶1。色谱柱为DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升温程序40 ℃恒温2min，以5℃/min升至180℃，然后从15℃/min升至230℃，5 min。

质谱（MS）条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度200℃，接口温度250℃。扫描范围33.00～350.00 u。

（2）乙酰辅酶A、ADH、AAT、Esterase酶活性的测定[27]

采用ELISA试剂盒检测样品中的乙酰辅酶A、乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、AAT、酯酶活性。酶标仪测定450 nm波长处各孔的OD450nm值，计算样品浓度。

（3）酒精度[28]：以乙醇计，GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》，密度瓶法测定。

1.3.4 感官评价[29]

以不同添加量L-苯丙氨酸处理的苹果醋为基础原料，加入蔗糖、蛋白糖、浓缩苹果汁等，调配成苹果醋饮料，经过均质、预热、灌装、密封，在95℃下保持10 min灭菌处理，冷却得到成品，组织30名品评人员，按表1的内容分别从色泽、香气、滋味和组织形态共四个方面进行评定并打分（满分100分计）。

表1 苹果醋饮料制品的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards of apple vinegar beverages

1.3.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0软件进行统计分析、采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 L-苯丙氨酸对乙酸-2-苯乙酯合成途径的影响

2.2.1 L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯相关基质浓度的影响

L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯及其相关基质浓度的影响结果见图1。由图1可以看出，随着L-苯丙氨酸添加量的增加，β-苯乙醇、乙酸、乙酰辅酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量均比对照样（不添加L-苯丙氨酸）的高，说明L-苯丙氨酸有明显的诱导乙酸-2-苯乙酯合成及其相关基质生成量积累的作用，具有剂量依赖性。和对照样相比，当L-苯丙氨酸添加量为8 g/L时，β-苯乙醇、乙酸、乙酰辅酶A、乙酸-2-苯乙酯的浓度均达到最大值，分别增加了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%。当L-苯丙氨酸添加量＞8g/L时，合成乙酸-2-苯乙酯及其相关基质生成量都出现下降的现象，可能是发酵过程中代谢物的高浓度蓄积，存在产物抑制效应，抑制了微生物生长，导致发酵代谢物产量下降。因此，初步将8 g/L作为L-苯丙氨酸的最佳添加浓度。该添加量条件下更有利于增加苹果醋发酵中特征性香气成分乙酸-2-苯乙酯的生物合成，对合成乙酸-2-苯乙酯的醇酰基转移酶途径和酯酶途径均有一定的影响。

大多数研究表明，L-苯丙氨酸质量浓度为5～10 g/L时为最佳底物浓度范围[30]，8 g/L L-苯丙氨酸最佳添加量，对β-苯乙醇转化量的影响与牛明福等[24]的研究结果是一致的，而其对乙酸、乙酰辅酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量的影响还未见相关报道。

图1 L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯及其相关基质浓度的影响Fig.1 Effect of L-phenylalanine on the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester and its related matrix concentration

2.2.2 L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯关键酶活性的影响

L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯关键酶活性的影响结果见图2。由图2可知，和对照样（不添加L-苯丙氨酸）相比，随着L-苯丙氨酸添加量的增加，ADH和AAT酶活性出现不同程度的增加，然而酯酶活性明显降低。其中，随着L-苯丙氨酸添加量的增加，苹果醋发酵液的ADH酶活均比对照样的高，说明L-苯丙氨酸对ADH酶活有明显诱导作用，可以诱导酒精发酵产生的乙醇转化为醋酸，L-苯丙氨酸添加量为8 g/L时，ADH酶活达到最大值，比对照样提高30.98%（P＜0.05）；和对照样相比，L-苯丙氨酸添加量为8 g/L时，AAT酶活达到最大值，而低浓度的L-苯丙氨酸对AAT酶活没有明显的诱导效果。因此，8 g/L的L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯关键酶ADH、AAT的酶活性均有一定的促进作用，推测L-苯丙氨酸添加量为8 g/L时，可以通过醇酰基转移酶途径促进乙酸-2-苯乙酯的合成，这与8 g/L的L-苯丙氨酸使得合成乙酸-2-苯乙酯及其相关基质（β-苯乙醇、乙酸、乙酰辅酶A）生成量的达到最大值的数据结果一致。但是，不同浓度的L-苯丙氨酸处理的苹果醋发酵液中酯酶活均比对照样的低（P＜0.05），说明L-苯丙氨酸对苹果醋发酵液的酯酶活却有一定的抑制作用，由于酯酶是可逆酶，可能是酯酶代谢途径太长，支路太多，L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯的酯酶途径影响的机理有待深入研究。

图2 L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯关键酶活性的影响Fig.2 Effects of L-phenylalanine on key enzymes activities in the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester

2.3 苹果醋饮料感官评价

不同添加量L-苯丙氨酸处理的苹果醋饮品的感官评价结果见表2。从表2的感官评价结果可以看出，对不同添加量L-苯丙氨酸处理的苹果醋饮料制品属于中上等级，其中8 g/L的L-苯丙氨酸处理的苹果醋饮料感官评价最优，具有较浓厚的香气和风味。

表2 不同添加量L-苯丙氨酸处理的苹果醋饮料制品的感官评价Table 2 Sensory evaluation of apple vinegar beverages treated with different L-phenylalanine addition

3 结论

在苹果醋发酵过程中，初步发现食品添加剂L-苯丙氨酸对合成乙酸-2-苯乙酯及其相关基质的生成量和关键酶活性有一定的影响。当L-苯丙氨酸添加量为8 g/L时，β-苯乙醇、乙酸、乙酰辅酶A、乙酸-2-苯乙酯的质量浓度分别提高了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%，且不同添加量的L-苯丙氨酸有明显诱导乙酸-2-苯乙酯合成及其相关基质生成量积累的作用，具有剂量依赖性；同时，L-苯丙氨酸可以诱导ADH将乙醇转化为醋酸、催化β-苯乙醇和乙酰辅酶A通过醇酰基转移酶途径生成乙酸-2-苯乙酯，却对酯酶活性有抑制作用，不利于乙酸-2-苯乙酯通过酯酶途径进行生物合成。综合考虑，初步推测将8 g/L作为L-苯丙氨酸的最佳添加量，通过醇酰基转移酶途径促进乙酸-2-苯乙酯的合成及其相关基质（β-苯乙醇、乙酸、乙酰辅酶A）的生成量和关键酶ADH、AAT的酶活性，经感官评价得出8 g/L L-苯丙氨酸处理的苹果醋饮料制品能较好的满足消费者的需求，为高品质苹果醋的技术研究和指导生产实践提供一定的理论依据。