不同菌种菊苣根发酵提取物的挥发性成分分析及应用

常 健，徐世涛，黄 静，刘劲云，王夸平，徐重军，陈 媛，王乃定，段焰青，李源栋，杨培香*

（1.云南中烟新材料科技有限公司，云南 昆明 650106；2.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650202）

菊苣（Cichorium intybus L.）是一种灌木丛生的多年生草本植物，根肉质、短粗[1]，产于东北、西北、华北、山东、山西等地[2]。菊苣为药食两用植物，菊苣叶可调制生菜，根含菊糖及芳香族物质，具有清热解毒、降压利尿[3]、健胃[4]、保肝作用[5]，同时还具有增强免疫能力、抗炎、降低胆固醇和血糖等功效[6-7]，目前被广泛用于咖啡、饮料、茶、保健品、食品、中药中。烘烤后的菊苣提取物具有类似可可或咖啡的焦香味，主要来源于菊苣干片经焙炒后发生美拉德反应产生的香味物质[8]，用于烟草加香中可改善刺激，增强劲头。菊苣提取物已成为烟草工业的重要香料之一，其主要含有三萜、倍半萜、有机酸等成分[9]，何轶等[10]对菊苣根的非挥发性成分进行了分析，鉴定出乙酸降香萜烯醇酯、蒲公英萜酮等12种化学成分。但对菊苣浸膏挥发性成分方面的研究报道相对较少；梁宇等[11]采用固相微萃取/气相色谱-质谱（solid-phase microextraction/gas chromatograph-mass spectrometer，SPME/GC-MS）联用技术对菊苣浸膏挥发性成分进行鉴定，共鉴定出38种化学成分；周静媛等[12]对云南禄劝、石林以及青海西宁三个不同产地栽培的菊苣进行挥发性成分分析对比，分别鉴定出29种、35种、26种化学成分。利用不同的菌种对菊苣根进行发酵，并对其发酵提取物挥发性成分进行分析和对比评吸，国内还未见报道。

由于所提及的菊苣根发酵提取物主要应用于卷烟加香，菌株的选择无先例可参考，拟选取在烟叶发酵过程中，能够使烟叶的青杂气、刺激性、香气质量等得到显著改善的菌株来对菊苣根进行发酵，段焰青等[13]从烟叶中分离出长孢诺德酵母菌（Lodderomyceselongisporus）并制成菌剂，喷洒于烟丝上进行发酵，有效的提高烤烟品质和增加烟叶香气，烟叶评吸品质得到明显提升；黄静文等[14]从烟叶表面分离出短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）制得菌剂，喷洒于烟丝上进行发酵，烟叶的化学成分及比值更加协调，烟叶香气质改善，香气量增加，烟叶内固有的杂气和刺激性减轻。因此，分别利用短小芽孢杆菌和酵母菌发酵微波预处理后的菊苣根提取物进行挥发性成分分析对比，并通过卷烟加香实验评价，探索不同菌种发酵菊苣提取物挥发性成分差异及对提高卷烟吸食品质的作用，为进一步开发菊苣根的香料价值提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菊苣根：云南石林基地；短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、长孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏号分别为CGMCCNO.3411、CGMCCNO.6645）；二氯甲烷、甲醇、正己烷（均为优级纯）、无水硫酸钠（分析纯）：百灵威科技有限公司提供；正构烷烃C7-C30：美国Sigma-Aidrich公司。

1.2 仪器与设备

Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；BUCHIR-215型旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；WF20B型粉碎机：上海比朗制造有限公司；1 000 mL同时蒸馏萃取装置：上海银泽仪器设备有限公司；Milli-Q型超纯水机：美国Millipore公司；MS204S万分之一电子天平：瑞士Mettler Tloede公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理方法

（1）菊苣根微波预处理

称取一定量的菊苣根，利用微波烘烤技术进行微波烘烤，微波功率45 kW，磁控管40根，出口温度控制在110～120℃之间，烘烤时间6 min。

（2）长孢诺德酵母菌发酵菊苣根提取物的制备

取长孢诺德酵母菌CGMCCNO.6645活化培养，得到酵母菌活化菌液；菌种活化培养条件为28℃、160r/min振荡培养，培养时间为28 h；将菊苣根粉碎后，添加15倍的水，灭菌制成待发酵样品；将上述活化好的菌液接种于待发酵样品中，菌株接种量为2%，发酵条件为转速160 r/min，发酵温度28℃，发酵时间36 h；发酵液经过滤、6 000 r/min离心后，取上清液。

（3）短小芽孢杆菌发酵菊苣根提取物的制备

取短小芽胞杆菌CGMCCNO.3411活化培养，得到短小芽孢杆菌活化菌液；菌种活化培养条件为37℃、150 r/min振荡培养，培养时间为16 h；将菊苣根粉碎后，添加15倍的水，灭菌制成待发酵样品；将活化好的菌液接种于待发酵样品中，菌株接种量为2.0%，发酵条件为转速150 r/min，发酵温度37℃，发酵时间16 h；发酵液经过滤、6 000 r/min离心后，取上清液。

（4）挥发性香味成分的提取

称取500 mL发酵上清液，倒入同时蒸馏萃取装置（simultaneous distillation extraction，SDE）左侧圆底烧瓶中，右侧烧瓶中加入100 mL二氯甲烷，向两个烧瓶中加入少许沸石，左侧烧瓶用电热套加热，右侧烧瓶60℃水浴加热，同时蒸馏萃取3 h。收集二氯甲烷溶液，加入15 g无水硫酸钠干燥12 h，除去水分，过滤，滤液减压浓缩至1 mL。

1.3.2 气相色谱-质谱检测部分

（1）色谱条件

RXi-5sil MS石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（纯度为99.999%），流速：1.0mL/min。升温程序：初始温度60℃，保持6 min；以3℃/min的速率升温至180℃；再以10℃/min的速率升温至230℃，保持10 min。进样口温度：250 ℃，进样量：1.0 μL，分流比：10∶1，溶剂延迟6 min。

（2）质谱条件

离子源：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；电离能量：70 eV；传输线温度：280℃；扫描范围（m/z）：40～450，质谱检索图库：Nist11谱库。

（3）定性方法

采用GC-MS测定酵母菌发酵菊苣根后提取物和短小芽孢杆菌发酵后提取物的挥发性化学成分，通过Nist11图库进行检索确定其组分。

（4）感官评价

两种菌种菊苣根发酵提取物添加到卷烟中后的感官评价及定性按照GB 5606.4—2005《卷烟第4部分：感官技术要求》规定的方法进行。

2 结果与分析

2.1 成分分析与鉴定

通过气相色谱-质谱联用仪测定两种发酵菊苣根提取物的挥发性成分，长孢诺德酵母菌发酵菊苣根提取物的挥发性成分质谱见图1，短小芽孢杆菌发酵菊苣根提取物的挥发性成分质谱见图2，通过谱库检索并结合标准质谱图和有关文献确定各组分，结合色谱峰面积归一化法定量计算各组分的相对百分含量，并对各成分气味特征进行描述[15，18]，具体结果见表1。

由表1可知，A提取物的挥发性成分主要包括有机酸类10种、醛类9种、酯类4种、醇类4种、吡啶类3种、酚类3种、吡嗪2种、酮类2种、烯烃类2种、吡咯类1种；B提取物的挥发性成分包括有机酸类7种、醛类7种、醇类3种、吡嗪类3种、酚类3种、酮类3种、酯类2种、吲哚1种、吡咯1种、吡啶1种。

图1 长孢诺德酵母菌发酵菊苣根挥发性成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of chicory roots fermented by Lodderomyces elongisporus

图2 短小芽孢杆菌发酵菊苣根挥发性成分的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components of chicory roots fermented by Bacillus pumilus

表1 不同菌种发酵菊苣根的挥发性成分及相对含量Table 1 Volatile flavor components and relative contents of chicory roots fermented by different strains

续表

两种菌种发酵菊苣根中共分析鉴定出44种挥发性成分，其中A提取物的挥发性成分40种，B提取物的挥发性成分31种，二者相同成分27种。A和B中相同的化学成分有糠醛、糠醇、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、γ-壬内酯、2-乙酰基吡咯、4-乙烯基愈创木酚、丁香酚、香兰素等。只存在于A中的挥发性成分有13种，分别是吡嗪、苯乙烯、2-乙酰基吡啶、壬醛、庚酸、异戊稀酸乙酯、喹啉、γ-壬内酯、（Z）-β-檀香醇、石竹烯氧化物、十五酸、亚油酸甲酯、油酸。B中独有的成分4种，分别是2,6-二甲基吡嗪、γ-己内酯、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、吲哚。两种发酵液中主要成分及含量比较见图3。

由图3可知，A中相对含量较高的成分依次为棕榈酸（21.65%）、糠醛（18.05%）、亚油酸（6.27%）、3-甲基戊酸（4.96%）、2-乙酰基呋喃（4.62%）、己酸（4.44%）、2-乙酰基吡咯（3.38%）；B中相对含量较高的成分依次为糠醛（20.36%）、棕榈酸（16.26%）、3-甲基戊酸（5.25%）、2-乙酰基呋喃（5.18%）、2-乙酰基吡咯（4.96%）、己酸（4.86%）、亚油酸（3.44%）。

图3 长孢诺德酵母（A）和短小芽孢杆菌（B）发酵菊苣根主要挥发性成分的比较Fig.3 Comparison of main volatile compositions in chicory roots fermented Lodderomyces elongisporus(A)and Bacillus pumilus(A)

棕榈酸具有调节烟草酸碱度，增加烟气浓度、甜味、蜡味和丰满度的功效，并间接影响烟草香气，在烟气中起到平衡作用[15]，但如果含量过高，会带来粗糙感和刺激性[16]；亚油酸会增加烟气的刺激性、粗糙感和蜡质感，对烟质不利[15]；棕榈酸和亚油酸在A和B中的相对总含量为27.92%和19.70%，二者含量越高，烟气的粗糙感和刺激性也越大[11]。

糠醛具有似面包、焦糖、谷物烘烤气息、果香，可赋予卷烟烘烤香、果香、甜香[15]，可使卷烟香气质细腻飘逸、烟气透发性好、烟气较饱满，以及带来一定的焦甜香和厚实留长感[17]；3-甲基戊酸是东方型卷烟中独有成分，可赋予卷烟甜感、乳酪、水果香气[18]；2-乙酰基呋喃具有草本的辛香[19]，应用于卷烟中，可增加焙烤香风味，改善烟气细味[18]；己酸可增加卷烟的甜味、蜡味，使烟气丰满醇和[15]；2-乙酰基吡咯具有增加烟气浓度，赋予烟草甜感，使烟草平和的作用[18]，是对卷烟香气有重要作用的吡咯类成分之一。以上几种成分的含量皆是B＞A，由图可知，7种主要挥发性成分分别占总量的63.37%、60.31%。这7种成分是构成发酵菊苣根香气的基础成分。此外，存在于A和B中的一些化学成分，虽然含量不高，但对卷烟烟气和吃味有重要作用，其中，有14种成分在A、B中含量无明显变化，分别是2-甲基四氢呋喃-3-酮、糠醇、2-环戊烯-1，4-二酮、5-甲基糠醛、三甲基吡嗪、2-吡咯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、邻甲氧基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、丁香酚、十五酸、硬脂酸、棕榈酸甲酯。有3种成分在B中明显大于A，分别是二甲基丁酸（0.62%）、苯乙醇（0.46%）、香兰素（0.24%）。2-甲基丁酸可以增进水果、酒香和乳脂香味，使烟气柔和滋润，改善辛辣刺激；苯乙醇通常用于增加卷烟香味的圆润和醇吸味[18]；香兰素则是一种与烟香味非常协调，赋予烟气丰满柔和的烟香风味，也可以用来修饰可可、坚果、脂香等香韵[15]。同时仅存在于B中的4种成分也是重要的致香物质：2,6-二甲基吡嗪具有明显的焦香或烤坚果香味，风味阈值极低[20]，可赋予烟草浓郁的烤香，对增强和改进烟草香味有明显作用[15]；γ-己内酯赋予烟草果香、豆香、奶香和糖蜜香，与烟香协调；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪有浓郁的可可香味，可赋予烟草烤香，丰富烟草香气；吲哚微量时有茉莉香，持久，用于烟用香精中，与烟香协调[18]。

综上，B中的挥发性成分虽然种类较少，但是构成发酵菊苣根中的基础性成分中主要致香成分含量较高，且对烟草吸味呈副作用的成分含量较少。

2.2 卷烟加香实验结果分析

不同添加量的两种菌种菊苣根发酵提取物添加到卷烟中后的感官评价及定性描述[21]，结果见表2和表3。

表2 卷烟感官质量评吸结果Table 2 Results of smoking sensory quality of cigarette

表3 卷烟感官评吸结果描述Table 3 Description of smoking sensory quality of cigarette

感官评吸结果表明，两种菌种发酵菊苣根提取物添加到卷烟中后抽吸品质均有所改善，具有掩盖杂气，纯净余味的作用，并使香气丰富饱满，烤甜香明显，烟气柔和透发，总体表现B＞A，添加比例以0.05%最佳。

3 结论

采用SDE/GC-MS法对菊苣根长孢诺德酵母菌发酵提取物（A）和菊苣根短小芽孢杆菌发酵提取物（B）的挥发性成分进行分析，并使用峰面积归一化法计算各成分相对百分含量，结果表明，两种菌种发酵菊苣根中共分析鉴定出41种挥发性成分，其中A提取物的挥发性成分40种，B提取物的挥发性成分31种，二者相同成分27种，分别是糠醛、糠醇、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、γ-壬内酯等。A中独有的成分为13种，B中独有的成分为4种。

研究结果表明，两种菌种发酵菊苣根提取物中均含有大量的棕榈酸、糠醛、亚油酸、3-甲基戊酸、2-乙酰基呋喃、己酸、2-乙酰基吡咯等挥发性成分，这7种成分既是构成发酵菊苣根香气的基础成分，也是卷烟中重要的香气成分，其有机结合形成了发酵菊苣根的特征烤香、焦甜香味。卷烟加香试验结果表明，菊苣根发酵提取物添加到卷烟中，具有掩盖杂气，纯净余味的作用，并使卷烟香气丰富饱满，烤甜香明显，烟气柔和，总体表现B优于A，添加比例以0.05%最佳。