黑曲霉泡腾片对烟草青枯病防效及烟株生长的影响

唐婧红，陈 雪*，代园凤，李 祝，杨佩斯，张 素，吉玉玉，张钦语，赵妗颐

（1.贵州省烟草公司毕节市公司，贵州 毕节 551700；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的一种维管束细菌性土传细菌性病害[1-2]，最典型的症状是枯萎。发病初期往往出现烟株一侧叶片枯萎，另一侧叶片正常。枯萎一侧茎上有黑色条斑，根系变黑腐烂。发病后期，整株枯死[3]，是制约烟草生产的主要病害[4]。

烟草青枯病的防治方法有农业防治、选育和栽培高抗品种、化学防治、生物防治等[5]。在我国，烟草青枯病的防治方法主要是化学防治，但是化学药物的长期使用不仅使病原菌产生抗药性而且会引起土壤、水体污染等[6]。因此，生物防治显得尤为重要[7]。近些年对于土传病害主要研究领域是利用植物根际促生细菌[8-9]和内生细菌[10]等方法来防治。据文献报道的防治烟草青枯病的拮抗细菌有芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌[11]、多粘类芽孢杆菌等）、假单胞菌（如铜绿假单胞菌[12]、荧光假单胞菌等）、放线菌（如灰白链霉菌、柠檬荧光链霉菌、极美链霉菌）等[13]。由于拮抗细菌容易受环境影响，所以局限于盆栽或小区试验，进入实际生产的很少[14-15]。目前，对于防治植物青枯病的真菌鲜有报道，主要停留在丛枝菌根真菌和烟曲霉方面[16]。刘先良等[17]发现，丛枝菌根真菌可促进烟草植株生长，烟株地上部和根系的干质量和磷含量以及地上部的氮含量显著增加，同时烟草青枯病的病情指数及发病率降低。周晓见等[18-19]从烟田分离出一株对青枯雷尔氏菌有稳定拮抗效果的真菌，鉴定为烟曲霉。

黑曲霉（Aspergillusniger）作为美国食品药品监督管理局认定的安全发酵菌种，其适宜在酸性环境下生长繁殖，菌体及发酵产物对人畜无害，不影响环境[20]。目前，有报道利用黑曲霉孢子粉粗提物对青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌植物病菌进行抑菌试验[21]和一种黑曲霉微丸对魔芋白绢病和软腐病进行防治[22]。黑曲霉泡腾片是一种新型的生防菌剂，它具有在水中快速崩解、携带方便、省时省力等特点[23]。本试验研究了黑曲霉泡腾片对烟草青枯病的防治效果和对烟草农艺性状的影响，以期为生防菌在烟草田间的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

烟草青枯雷尔氏病菌（Ralstoniasolanacearum）CQ11-2：分离自贵州省毕节地区大方县烟草青枯病株，保存于贵州大学生命科学学院微生物实验室。黑曲霉（Aspergillusniger xj）：由贵州大学真菌资源研究所分离，保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏号：CCTCCNO：M206021。

二甲基亚砜（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；氯霉素（分析纯）：北京索宝来科技有限公司；氯化钠（分析纯）：重庆川东化工集团有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：上海盛思生化科技有限公司。

1.1.2 供试烟草品种

烟草品种云烟87：由贵州省烟草公司毕节市公司田坝镇烟草基地提供。

1.2 仪器与设备

BIOMATE 3S紫外分光光度计：赛默飞世尔科技有限公司；HPD-68A恒温摇床：常州市华普达教学仪器有限公司；SW-CJ-1FD单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备

将青枯雷尔氏病菌接种在牛肉膏蛋白胨斜面上于30℃培养箱中培养24 h后，用无菌水冲洗斜面并稀释成1×108CFU/mL，备用。

1.3.2 黑曲霉泡腾片抑菌试验

将黑曲霉孢子粉泡腾片、泡腾片辅料溶于二甲基亚砜，配制成质量浓度为500 mg/mL的溶液。在无菌条件下，分别向1 mL的液体牛肉膏蛋白胨培养基中加入10 μL上述溶液，使培养体系终质量浓度为5 mg/mL。按20%的接种量接入菌悬液，以二甲基亚砜为溶剂对照、氯霉素为药物对照。每个处理组3个平行实验，在37℃、150 r/min的条件下进行摇床培养，培养12 h，最大吸收波长420 nm处测定其OD420nm值，进而计算其抑菌率。抑菌率计算公式为：

1.3.3 育苗试验

黑曲霉泡腾片生防菌剂对烟苗生长试验于2018年2月28日至4月20日在毕节市七星关区田坝镇试验苗棚进行。参照黑曲霉泡腾片制备工艺优化的方法[23]，制备黑曲霉泡腾片。将黑曲霉泡腾片与水按1∶1 000（g∶mL）的比例投入育苗池中，将育苗盘置于带水的育苗池内，以清水培育的烟苗作对照，烟苗移栽前随机抽取10株烟苗，测量并记录其叶片数、株高、根长、鲜质量、干质量、最大叶长、叶宽。

1.3.4 盆栽试验

选取长势一致的烟苗（4片真叶）移栽至盆中。分成6组，每组4个重复。移栽后分别浇灌清水、稀释800倍、1 000倍、1 200倍的泡腾片和稀释800倍、1 000倍和1 200倍的多粘类芽孢杆菌的定根水，一天一次，一次50 mL，一周后全部统一浇清水，烟草长至6～8叶，备用。

（1）农艺性状

参照行业标准YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查方法》调查其叶片数、株高、最大叶长、叶宽等农艺性状。

（2）病情调查

注射器抽取30 μL浓度为108CFU/mL的菌悬液，用针头在叶片主脉两侧不完全对称的位置上各刺2～3下，取下针头，用注射器注孔抵压住已刺孔部位，将菌悬液注射至上下表皮之间。每处理接种3片叶，重复4次，清水作对照，每天观察记载叶片注射区症状的变化。10 d后以叶片为单位进行病情分级[24]，分级标准见表1[25]。

表1 叶片病情分级标准Table 1 Grading standards of leaf disease

病情指数和防治效果计算公式如下：

1.3.5 大田试验

大田试验在贵州省毕节市七星关区田坝镇烟草试验基地进行。分别设2个处理，即稀释1 000倍黑曲霉泡腾片和清水（对照）作定根水，每个处理3个重复区组，每区组60株烟株，行距1.2 m，株距0.5 m，随机区组排列。参照行业标准YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查方法》[26]，采用5点法取样，每点调查5株，分别在团棵期、旺长期调查烟草株高、叶片数、茎围和最大叶长、叶宽等主要农艺性状。

1.3.6 分析测定

抽取对照与施用黑曲霉泡腾片的初烤烟叶中部混合样品，送至贵州省烟草科学研究院分析检测研究中心进行感官质量检测，贵州省烟草科学研究院评烟委员会进行评吸，感官评吸标准见表2[27]。

表2 烟叶感官评吸标准Table 2 Smoking sensory evaluation standard of tobacco leaf

1.3.7 数据处理

采用SPSS进行数据处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉泡腾片抑菌效果

黑曲霉泡腾片、辅料、二甲基亚砜、氯霉素对青枯雷尔氏菌的抑菌效果表明，黑曲霉泡腾片与氯霉素对青枯雷尔氏菌有较好的抑制作用，抑菌率达分别82.88%和93.23%，而辅料和二甲基亚砜对青枯雷尔氏菌无抑菌作用。为后续的防治烟草青枯病提供了良好的依据。

2.2 黑曲霉泡腾片对烟草育苗的影响

黑曲霉泡腾片对烟草育苗的影响结果见表3。

由表3可以看出施用黑曲霉泡腾片的烟草的农艺性状优于对照组。其中叶片数、叶长、叶宽、株高、鲜质量、干质量较对照分别增加了6.70%、42.09%、29.28%、9.42%、105.16%、70.07%。叶长、叶宽和鲜质量与对照间差异显著（P＜0.05）。

表3 黑曲霉泡腾片对烟草育苗的影响Table 3 Effect of Aspergillus niger effervescent tablets on tobacco seedling growth

2.3 黑曲霉泡腾片对烟草盆栽生长的影响

2.3.1 不同稀释倍数泡腾片与多粘类芽孢杆菌对烟草生长的影响

将黑曲霉泡腾片分别稀释800倍、1 000倍、1 200倍，多粘类芽孢杆菌稀释1 000倍、1 200倍为生物对照药，清水为对照，测量其叶片数、叶长、叶宽、直径和株高，结果见表4。

表4 不同稀释倍数对烟草生长的影响Table 4 Effect of different dilution times on tobacco growth

由表4可知，黑曲霉泡腾片稀释800倍的处理组的农艺性状优于清水对照和其他浓度处理，多粘类芽孢杆菌稀释1 200倍（除株高）的农艺性状优于同种药物的其他稀释倍数的农艺性状。通过方差分析，不同处理均与对照间差异显著（P＜0.05）。其中黑曲霉泡腾片施用效果最佳为稀释800倍，株高比对照增加80%，叶长比对照增加37.8%、叶宽比对照增加40.37%、直径比对照增加25%、叶片数比对照增加60%。而多粘类芽孢杆菌处理组中，稀释1 200倍效果最佳，株高比对照增加37.8%、叶长比对照增加23.8%、叶宽比对照增加15.12%、直径比对照增加25%、叶片数比对照增加55%。综上，施用稀释800倍黑曲霉泡腾片的烟株农艺性状最优。

2.3.2 不同稀释倍数对烟草青枯病的防治效果

不同稀释倍数对烟草青枯病的防治结果见表5，通过盆栽试验，结果表明，黑曲霉泡腾片稀释1200倍和稀释1000倍，相对防效为71.4%，优于生防农药多粘类芽孢杆菌稀释1200倍的防效（42.9%），当泡腾片稀释800倍，相对防效高达92.9%。由此可见，黑曲霉泡腾片的防治效果突出。考虑到成本问题，在进行大田试验时，发病严重的地块，采用800倍稀释的药剂进行预防，而发病较轻的地块采用1 000倍稀释的药剂进行预防。

表5 黑曲霉泡腾片对烟草青枯病温室防效Table 5 Effect of Aspergillus niger effervescent tablets on greenhouse control of tobacco bacterial wilt

2.4 大田试验结果

采用1 000倍稀释的药剂进行预防，不同处理组烟叶的农艺性状见表6。

表6 不同处理各生育期农艺性状Table 6 Agronomic traits at different growth stages under different treatments

由表6可知，黑曲霉泡腾片处理烟叶团棵期和旺长期的农艺性状都优于对照组，其中团棵期的叶片数比对照增加47.3%、叶长比对照增加38.21%、叶宽比对照增加65.31%、直径比对照增加84.21%、株高比对照增加58.98%，叶片数、叶长、叶宽、直径和株高与对照间存在显著差异（P＜0.05）。旺长期的叶片数比对照增加58.98%、叶长比对照增加8.62%、叶宽比对照增加19.24%、直径比对照增加28.9%、株高比对照增加5.31%。叶片数、叶长、叶宽、直径与对照间有显著差异（P＜0.05）；株高与对照间没有显著差异（P＞0.05）。总的来说，1000倍稀释的黑曲霉泡腾片在团棵期和旺长期对烟草有明显的促生效果。由于田间对照和施用黑曲霉泡腾片的田块都未发生烟草青枯病，所以没有采集到大田防效的数据。

2.5 烟叶评吸质量

黑曲霉泡腾片处理的烟叶的感官评吸结果见表7。由表7可知，施用黑曲霉泡腾片的烟叶评吸结果均优于对照。说明施用黑曲霉泡腾能改善烟叶香气质，增加烟叶香气量，使余味更加舒适，减轻烟叶的杂气和刺激性，提高烟叶的可用性。

表7 烟叶评吸结果Table 7 Smoking evaluation results of tobacco leaf

3 结论

本试验以云烟87为试材，通过盆栽试验和大田试验对黑曲霉泡腾片的生防效果和促生效果进行探究。盆栽试验表明，黑曲霉泡腾片稀释800倍时，对烟草青枯病的防治效果可达92.9%，显著高于多粘类芽孢杆菌（42.9%）的防效，且有良好的促生效果。对采集的团棵期、旺长期烟株农艺性状的大田数据进行分析，结果表明，黑曲霉泡腾片对烟株的生长有明显的促进作用，而且可以改善烟叶香气质，增加烟叶香气量，使余味更加舒适，减轻烟叶的杂气和刺激性，提高烟叶的可用性。黑曲霉作为美国食品及药物管理局认定的安全发酵菌种，因而具有很强的应用潜力，但是关于黑曲霉泡腾片的促生机理、定殖能力和对烟草的经济性状的影响还需进一步的研究。