降解玉米秸秆的毛头鬼伞菌株的初步筛选*

杨文琪，黄 亮，孙 宁，王 玉，班立桐，杨红澎

（天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384）

中国的秸秆资源十分丰富，约占农作物生物学产量的60%，其中稻秸秆产量最大，约占总秸秆产量的29.93%；其次是玉米秸秆，约占总秸秆产量的27.39%［1］。秸秆作为天然木质纤维素，约由35%纤维素、15%半纤维素、15%木质素3部分组成。其中木质素呈网状结构，形成支撑纤维素和半纤维素的骨架，以共价键的形式紧密的连接在一起［2］。研究发现，玉米秸秆的木质纤维素极难被分解。这是由于玉米秸秆韧皮部的木质素含量很高，木质素化学结构稳定，导致一般微生物很难降解木质素并分解内部的纤维素［3］。因此，在对玉米秸秆木质纤维素的生物降解过程中，降解木质素是关键。

毛头鬼伞（Coprinus comatus） 属于伞菌目（A-garicales） 鬼伞科 （Psathyrellaceae） 鬼伞属 （Coprinus），因其子实体未开伞、形似火鸡腿，故又称为鸡腿菇，是一种白腐类蕈菌［4］。Ward G.等［5］的研究表明，白腐类蕈菌对木质素利用没有选择性，能够同时降解木质素、纤维素、半纤维素，可充分利用秸秆中木质纤维素并且释放大量代谢能量。刘朝贵等［6］用稻草为主要培养基原料，栽培毛头鬼伞，研究稻草对毛头鬼伞胞外酶活性的影响。结果表明，毛头鬼伞在菌丝体生长时期主要利用漆酶，子实体生长时期主要利用纤维素酶。

秸秆木质素的生物降解主要以漆酶为木质素降解酶［7］，纤维素的降解主要依靠羧甲基纤维素酶，半纤维素的降解主要依靠木聚糖酶［8］。研究发现，在PDA培养基中加入芳香类化合物染料，其能与酶类发生显色或褪色现象，可判断食用菌能否产生木质素降解酶及产酶能力的强弱［9］。本试验选取5株不同来源的毛头鬼伞菌株，通过平板筛选和酶活性检测等方法，比较其分解玉米秸秆木质纤维素的能力，旨在筛选降解玉米秸秆能力较强的菌株。可为生物降解、循环利用农业废弃物玉米秸秆资源提供较好的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株具体情况见表1。

表1 试验菌株Tab.1 Test strain

1.1.2 供试玉米秸秆

玉米秸秆原料采自天津农学院静海良种厂试验地。在烘箱内105℃下杀青2 h，然后80℃烘干至恒重。自然冷却后用粉碎机粉碎，过60目筛备用。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，蒸馏水 1 000 mL，pH自然。

PDA-愈创木酚培养基：在1 000 mL PDA培养基上加入0.4 mL愈创木酚。

无机盐基础培养基［10］：KH2PO41.0 g、CaCl20.5 g、 CoCl21.7 mg、 FeSO45 mg、（NH4）2SO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、 MnSO4·7H2O 1.6 mg、ZnCl21.7 mg、琼脂20 g，超纯水1 000 mL。

产纤维降解酶液［11］：KH2PO41.0 g、CaCl20.013 g、K2HPO40.4 g、NH4NO30.5 g、VB10.002 5 g、玉米秸秆粉10 g，超纯水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 毛头鬼伞菌株降解玉米秸秆的初筛

1）毛头鬼伞菌株降解纤维素平板试验

将保藏的毛头鬼伞供试菌株，转接到PDA培养基平板上活化，长满后用打孔器在平板上制出菌块。将微晶纤维素（2.0 g） 加入1 000 mL基础培养基中，制成以纤维素为唯一碳源的固体培养基平板。将菌块置于固体培养基的中心，23.5℃下培养，每个菌株做3个重复。从菌丝萌发起，每隔24 h用直尺测量菌落直径，取平均值。

2）毛头鬼伞菌株降解木质素平板试验

本试验采用愈创木酚显色法，对5个毛头鬼伞菌株进行漆酶显色反应试验，将制备好的菌块接种到PDA-愈创木酚培养基平板中心，23.5℃下培养，每个菌株3个重复。从菌丝萌发起，每隔24 h进行观察，分别测量菌落和变色圈的直径。

3）毛头鬼伞菌株降解玉米秸秆平板试验

将玉米秸秆粉（10 g） 加入1 000 mL基础培养基中，制成以玉米秸秆为碳源的固体培养基平板。试验方法同上。

1.2.2 液体培养毛头鬼伞产纤维降解酶的试验

1）不同毛头鬼伞菌株产纤维降解酶培养试验

将初筛中选出的3个毛头鬼伞菌株，制备菌块。接入产纤维降解酶液，于23.5℃、150 r·min-1的摇床中培养，从第4天起每隔2 d取样检测其所产漆酶、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的酶活性，3次重复。

2）漆酶、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶酶活力的测定

粗酶液制备：取10 mL种子液于离心管中，4℃下4 000 r·min-1离心20 min，取上清液。

漆酶酶活性测定：向96孔板中加入0.15 mL的50 mmol·L-1的醋酸钠缓冲液，50 μL稀释10倍的粗酶液，0.1 mL的1 mmol·L-1ABTS，以蒸馏水作为对照，使用酶标仪测定436 nm处5 min内的光吸收值的变化。

羧甲基纤维素酶测定：将1.5 mL的羧甲基纤维素钠溶液（用pH 5.0的50 mmol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制）和0.5 mL的粗酶液，加入25 mL刻度试管中，40℃水浴保温30 min。取出后立即加入3 mL DNS试剂，煮沸10 min后冷却至室温，用蒸馏水定容至25 mL，充分摇匀。用酶标仪测定540 nm处的吸光值，以煮沸灭活30 min的酶液作为对照。

木聚糖酶活性测定：将0.9 mL的榉木木聚糖溶液（用pH 5.0的50 mmol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制） 和0.1 mL的粗酶液加入25 mL刻度试管中，40℃水浴保温30 min。取出后立即加入3 mL DNS试剂，煮沸10 min后冷却至室温，用蒸馏水定容至25 mL，充分摇匀。用酶标仪于540 nm处测吸光值，以煮沸灭活30 min的酶液作为对照。

2 结果与分析

2.1 毛头鬼伞菌株降解玉米秸秆的初筛

2.1.1 毛头鬼伞菌株降解纤维素能力比较

不同毛头鬼伞菌株降解纤维素能力比较情况见图1。

由图1所示，5个毛头鬼伞菌株在以微晶纤维素为碳源的平板培养基上均可生长，其中长势较好的菌株为1号菌株、2号菌株、4号菌株，在培养的第7天，其菌落直径分别达到6.95 cm、6.73 cm、6.26 cm；5号菌株长势最差，在第7天菌落直径为5.74 cm。

图1 不同毛头鬼伞菌株以微晶纤维素为碳源的生长情况Fig.1 Growth of different strains of Coprinus comatus using microcrystalline cellulose as carbon source

2.1.2 毛头鬼伞菌株降解木质素能力比较

毛头鬼伞菌株主要通过漆酶对木质素进行降解。漆酶可以和愈创木酚反应，具有漆酶活性的菌株菌落周围会呈阳性反应，形成红棕色显色圈，且显色圈直径、颜色深浅可以有效反应漆酶活性大小［7］。具体结果见表2。

表2 不同毛头鬼伞菌株产漆酶能力比较Tab.2 Comparison of the laccase production abilities of different strains of Coprinus comatus

从表2中可以看出，5个毛头鬼伞菌株在愈创木酚平板上均呈红棕色，发生显色反应，表示都具有产生漆酶的能力。PDA-愈创木酚培养基的变色圈和菌落直径会随着培养时间不断增长，变色圈颜色的深浅和菌落直径的大小均存在差异，其中2号菌株、1号菌株、4号菌株变色圈直径较大、变色程度较深，菌丝生长较快。5号菌株变色圈最小，菌丝生长速度慢。

2.1.3 毛头鬼伞菌株降解玉米秸秆能力比较

不同毛头鬼伞菌株以秸秆为碳源生长的情况见图2。

图2 不同毛头鬼伞菌株以秸秆为碳源的生长情况Fig.2 Growth of the different strains of Coprinus comatus using straw as carbon source

从图1和图2可以看出，5个毛头鬼伞菌株在以秸秆为碳源的平板培养基上的生长状况比在微晶纤维素平板好，1号菌株、2号菌株、4号菌株在第7天，菌落直径就达到了7.75 cm、7.31 cm、6.92 cm。这是由于玉米秸秆中的营养成分比微晶纤维素复杂和丰富，除了含纤维素还有其他碳源和营养物质［12］。综上所述，在培养的第6天，1号菌株、2号菌株、4号菌株在微晶纤维素平板、秸秆平板、PDA-愈创木酚平板上，菌落的生长情况均优于3号菌株和5号菌株。

2.2 液体培养毛头鬼伞产纤维降解酶能力比较

利用平板试验中筛选出的3株（1号、2号、4号），具有较强降解木质纤维素能力的毛头鬼伞菌株，在以玉米秸秆为唯一碳源的液体培养基中培养，通过比较玉米秸秆降解过程中羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶的酶活性，进一步判定毛头鬼伞菌株对玉米秸秆的降解能力。

2.2.1 毛头鬼伞菌株产羧甲基纤维素酶酶活性的比较

不同毛头鬼伞菌株产羧甲基纤维素酶酶活性的比较情况见图3。

图3 不同毛头鬼伞菌株产羧甲基纤维素酶活性的比较Fig.3 Comparison of the activity of carboxymethyl cellulase produced by different strains of Coprinus comatus

羧甲基纤维素酶是降解纤维素的相关酶类，由图3所示，3个毛头鬼伞菌株在整个液体培养周期中均具有羧甲基纤维素酶酶活性，且随着培养时间的延长，羧甲基纤维素酶酶活性不断变化。在培养初期3个菌株的羧甲基纤维素酶酶活性均较低，随着培养时间的延长，酶活性逐渐升高，在第10天到达峰值，第12天开始下降。其中2号菌株的羧甲基纤维素酶酶活性最高，达到4.05 U·mL-1，高于其他2个菌株，1号菌株和4号菌株的羧甲基纤维素酶酶活性均在3.30 U·mL-1左右。

2.2.2 毛头鬼伞菌株产木聚糖酶酶活性的比较

不同毛头鬼伞菌株产木聚糖酶酶活性的比较情况见图4。

图4 不同毛头鬼伞菌株产木聚糖酶酶活性的比较Fig.4 Comparison of the xylanase activity produced by different strains of Coprinus comatus

木聚糖酶是降解半纤维素的酶类，通过图4可见，3个毛头鬼伞菌株的木聚糖酶酶活性趋势大致相同，在培养6 d内，木聚糖酶酶活性水平一直较低，随后迅速升高，在培养的第10天达到最大值，在第12天有所下降。培养的第10天，1号菌株酶活性最高达到42.36 U·mL-1，其次是2号菌株，菌株酶活性为40.65 U·mL-1，4号菌株最低，酶活性为38.27 U·mL-1，3个菌株木糖酶酶活性均较高。

2.2.3 毛头鬼伞菌株产漆酶酶活性的比较

漆酶是降解木质素的主要酶类，不同毛头鬼伞菌株产漆酶酶活性的比较情况见图5。

图5 不同毛头鬼伞菌株产漆酶活性的比较Fig.5 Comparison of the laccase activity of different strains of Coprinus comatus

如图5所示，3个毛头鬼伞菌株的酶活表现一致，均呈逐渐上升然后下降的趋势，在培养的第10天达到最大值，第12天酶活性下降。其中1号菌株漆酶酶活性最高，为10.39 U·mL-1，其次是2号菌株，漆酶酶活性为9.89 U·mL-1，4号菌株最低，漆酶活性为 9.37 U·mL-1。

3 结论

毛头鬼伞降解玉米秸秆平板试验中，通过5株毛头鬼伞菌株在玉米秸秆、微晶纤维素为唯一碳源的平板培养基，以及作为指示剂检测漆酶含量的PDA-愈创木酚平板培养基上的生长情况，可以初步判定1号菌株、2号菌株、4号菌株具有较强的产木质素、纤维素相关酶类，以及降解木质素和纤维素的能力。

利用平板中筛选出的3个毛头鬼伞菌株，在以玉米秸秆为唯一碳源的液体培养基进行酶活力测定试验。结果表明，3个菌株的酶活性变化较一致，培养初期，3个菌株所产酶的酶活性均较低，酶活性从培养的第4天开始逐渐升高，在第10天时酶活性达到峰值，12 d后开始逐渐下降。其中1号菌株的木聚糖酶酶活性最强，在培养的第10天木聚糖酶酶活性达到42.36 U·mL-1，这可能是由于半纤维素成分复杂而诱导产生多种半纤维素酶［13］。并且1号菌株在培养的第8天漆酶活性达到了8.84 U·mL-1，这是因为毛头鬼伞作为白腐类蕈菌，具有分泌胞外氧化酶降解木质素的能力［14］，所以漆酶在前期增长速度高于其他2种酶，由此可见1号菌株分泌木聚糖酶、漆酶能力均强于其他菌株。通过试验结果可以看出，毛头鬼伞菌株能够产生大量的木质素降解酶，能够降解秸秆中外层的木质素，促进秸秆内部纤维素和半纤维素的降解，从而充分利用秸秆中的木质纤维素，这与孙江慧的研究结果相一致［15］。综上所述1号菌株具有降解玉米秸秆的优势，可为生物降解、循环利用农业废弃物玉米秸秆资源提供较好的依据。