异烟肼致小鼠肝损伤的建模及线粒体靶向药物MitoQ的干预作用

吴银霞 ，陈成伟 ，傅青春 *，程明亮 ，张懿

（1.丽水市中心医院，浙江 丽水 323000；2.中国人民解放军第八五医院，上海 200006；3.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳550025）

异烟肼（isoniazid，INH）是临床一线抗结核药，但也易诱发药物性肝损伤 （Drug Induced Liver Injury，DILI）。研究表明，20%接受INH治疗的患者其谷丙转氨酶（ALT）升高，1%可出现严重肝毒性甚至肝衰竭[1-2]。早期研究认为[3-4]，INH通过乙酰转移酶2（NAT2）乙酰化，释放游离肼产生肝毒性。后期研究[5]发现，INH肝毒性与个体易感性、遗传多态性密切相关。近年来，Metushi等[6]在INH肝损伤患者体内找到了抗INH抗体和自身抗体，认为INH诱发药物性肝损伤有免疫机制参与其中，但前期研究均未阐明其发病机制。线粒体是一个产生活性氧的场所，特别容易受到氧化应激损伤。药物性肝损伤大多能引起线粒体氧化应激，如顺铂、对乙酰氨基酚引起的急性肝毒性，非阿尿苷和丙戊酸引起的肝脏小泡性脂肪变性，INH与利福平合用可引起线粒体氧化应激和MPT膜孔开放等[7-8]。线粒体或许是药物性肝损伤的最终作用靶点。因此，本文建立INH肝损伤动物模型，研究INH肝毒性的线粒体损伤机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 异烟肼原药购自sigma公司。3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）抗体和 4-羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal，4-HNE）抗体生产厂商为北京博奥森生物技术有限公司，MitoQ购自苏州沃盛化学有限公司，线粒体提取试剂盒购自碧云天生物技术研究所，山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）试剂盒购自上海朗顿生物有限公司，其余试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物分组 36只C57B/6J小鼠，SPF级，雄性，6周龄，体质量20～25g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[许可证号：SCXK（沪）2007-0005]，饲养于上海中医药大学动物实验中心。所有小鼠在实验前适应性喂养1周[自由饮食水，昼夜均衡，温度20～25℃，湿度（50±5）%]。采用随机数字表法将小鼠分为对照组、模型组、MitoQ干预组，每组各12只，分别给予生理盐水（10mL/kg）、异烟肼（100mg/kg）、异烟肼（100mg/kg）+线粒体抗氧化剂MitoQ进行灌胃处理，2次/d，共造模14天。MitoQ干预组于造模前2周将饮用水配置成MitoQ（500uM）供小鼠自由饮用。每组再分成两小组，每组各6只，分别于造模第5天和第14天处死，并进行肝脏组织细胞及生理生化检测。

1.3 标本制备 所有小鼠于末次灌胃后禁食12小时，5%戊巴比妥钠0.1mL/20g腹腔注射麻醉，采用眼球摘除法收集血液，储存于1.5mL离心管，室温静置4小时，3000rpm离心10分钟，提取血清-20℃保存备用。颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹完整剥离肝脏组织，剪取5mm×5mm×2mm肝组织放入10%福尔马林固定，用于制作肝脏病理切片。在冰上称取50mg肝脏组织，当即用试剂盒提取线粒体，剩余肝组织-80℃保存，用于后续指标检测。

1.4 指标检测 （1）ALT和AST按试剂盒说明书采用微板法进行操作，用酶标仪测定510nm波长处各孔OD值，并绘制标准曲线。根据标准曲线得出ALT和AST的卡门氏单位，并换算成酶活力单位IU/L。1卡门氏单位=0.482IU/L。（2）SDH 检测根据小鼠山梨醇脱氢酶试剂盒说明进行酶联免疫吸附法（ELISA）检测。（3）LDH按试剂盒说明书测定酶标仪450nm处的吸光度。（4）T-GSH和GSSG检测取冻存的肝脏组织进行匀浆，用BCA法测定样本蛋白浓度，按试剂盒说明书在412nm处分别检测两者的吸光度，通过公式计算GSH和GSSG含量。（5）ATP采用比色法检测其在636nm处的吸光度，通过公式计算ATP含量。（6）NADH和FADH采用双抗体一步夹心法ELISA，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性（U/mL）。（7）线粒体膜电位测定（Δψ）：JC-1 是检测 Δψ 的理想荧光探针，提取线粒体后用线粒体缓冲液调整蛋白浓度至1mg/mL，然后按JC-1膜电位检测试剂盒说明书配制JC-1染色工作液，取24孔板，在0.9mL 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1mL纯化的线粒体。用荧光酶标仪将激发波长设置为485nm，发射波长设置为590nm进行检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料用（±s）表示，正态性检验后做方差齐性检验，多组间比较方差齐性者采用单因素方差分析，SNK法分析组间差异；方差不齐者采用秩和检验。

2 结果

2.1 造模情况 MitoQ干预组小鼠给予INH 100mg/kg，5天后6只中4只发生轻度肝脏脂肪变性，以局部小泡性改变为主；14天后6只剩余小鼠均发生肝脏脂肪病变，肝细胞内弥漫性小泡性脂肪变性，血管周围轻度炎症，有嗜酸性粒细胞浸润，中央静脉旁有点状坏死，凋亡小体（图1）。按照DILI半定量评分表[9]，评为5分，定义为“很可能”，说明造模成功。

2.2 肝脏病理表现 对照组肝小叶结构正常，未见炎症细胞浸润（图2A-2B）。模型组5天后有4只小鼠发生轻度脂肪变性，局部小泡性脂肪变性（图2C）；14天后所有小鼠均发生肝脏弥漫性脂肪变，甚至可见嗜酸性粒细胞浸润和凋亡小体 （图2D）。MitoQ干预组5天后仅1只小鼠出现轻度脂肪变性 （图2E），14天后小叶中央静脉旁脂肪变性减轻，有少量炎症细胞浸润（图2F）。

图2 各组肝脏病理组织学表现（×400）

2.3 肝脏损伤指标

2.3.1 肝功能指标 与对照组比较，造模后5天模型组LDH有显著升高（P＜0.05），SDH于14天时显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），两组ALT、AST 差异无统计学意义（P＞0.05）；MitoQ 干预后5天及14天，LDH均较模型组显著下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。详见表1。

2.3.2 肝脏氧化应激指标 与对照组比较，造模后5天及 14天模型组 GSSG、GSSG/GSH、4-HNE及3-NT均明显升高 （均P＜0.05），GSH则显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。MitoQ 干预后，GSSG、GSSG/GSH、4-HNE及3-NT均较模型组明显下降，GSH则显著回升，差异均有统计学意义 （均P＜0.05）。 详见表 2。

2.3.3 肝脏线粒体指标 与对照组比较，造模后5天及14天模型组NADH、FADH、ATP、线粒体膜电位均明显下降，差异有统计学意义 （均P＜0.05）。MitoQ干预后，NADH、FADH、ATP较模型组均显著升高，但线粒体膜电位下降更明显，差异有统计学意义（均P＜0.05）。 详见表 3。

表1 各组小鼠生化指标比较（x±s）

表2 各组肝脏氧化应激指标比较（x±s）

表3 各组肝脏线粒体指标比较（x±s）

3 讨论

近年DILI的发病率逐年增多，而脂肪变性则是其基本病理类型。INH在多种动物模型上均可诱发小泡性脂肪变性[10-11]，Metushi等[12]则发现INH在小鼠体内的代谢与人体更为相似，小鼠可能更适合作为INH肝损伤的动物模型。INH在体内代谢较快，小剂量多次给药比单次大剂量给药更容易引起肝损伤[13]，因此本研究选择1天2次给药的方式进行造模。在预实验时观察1-30天不同剂量连续INH给药，发现小鼠INH 100mg/kg连续5天即可发生部分肝损伤现象，连续给药2周可发生弥漫性肝脏脂肪变性。基于造模效果、时间、经济成本等诸多因素，最终本研究选择5天和14天两个时间点进行分组研究。结果发现，INH给药剂量为100mg/kg，连续给药5天可引起部分小鼠发生局部小泡性脂肪变性，可见散在嗜酸粒细胞；而连续给药14天可致全部小鼠发生弥漫性小泡性脂肪变性，嗜酸粒细胞及凋亡小体均较5天增多，可以达到最佳造模效果。

本研究病理模型显示，INH引起肝脏弥漫性小泡性脂肪变性，而药物诱导肝脏脂肪变性通常与线粒体损伤相关[14]。线粒体的主要功能是产生能量，参与细胞内三羧酸循环、脂肪酸代谢及氧化磷酸化。药物可通过多方面损伤线粒体[15-17]，如抑制线粒体呼吸链，导致ATP合成受阻；破坏抗氧化防御系统，引起氧化损伤；抑制脂肪酸β-氧化，引起肝脏脂肪变性；损伤线粒体DNA（mtDNA），抑制线粒体的新生和修复；MPT膜孔开放，引起线粒体膜破裂等。本研究结果显示，与对照组比较，模型组线粒体功能损伤显著，如传递电子和质子的线粒体呼吸链NADH、FADH活性明显下降，其功能异常可直接影响线粒体内的β-氧化和三羧酸循环。同时，模型组ATP明显减少，ATP是生物体内能量转换最基本的载体，其含量变化直接关系到各器官的能量代谢。Lee等[18]在细胞水平上同样发现了INH对线粒体呼吸链NADH的影响。线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件，模型组线粒体膜电位明显下降，说明线粒体膜受到了直接损伤。

本研究发现氧化应激或许在线粒体损伤中也起到了关键作用，模型组GSSG、GSSG/GSH升高，说明INH引起了肝组织发生氧化应激反应。同时，肝脏脂质过氧化指标4-HNE、活性氧及活性氮的硝基化指标3-NT在模型组中的表达增加，说明肝细胞生物膜同样发生了氧化损伤。因此，INH可通过氧化应激引起肝脏线粒体损伤，进而导致肝脏脂肪变性。MitoQ是目前为止最好的线粒体靶向抗氧化剂，它能将泛醌与亲脂性三苯基膦（TPP）阳离子共价结合，通过线粒体膜电位进入线粒体内，吸附于内膜表面，发挥抗氧化作用[19]。最近报道[20-21]指出，MitoQ能保护心脏缺血再灌注损伤、干预糖尿病肾病、阿霉素的心脏毒性和丙型肝炎等。本研究同样发现，MitoQ能有效干预氧化应激指标GSSG和4-HNE、3-NT的表达，减轻肝脏脂肪变性，同时对线粒体呼吸链的活性和ATP含量有一定保护作用。这为临床DILI患者预防性应用抗氧剂提供了实验数据支持。但本研究中，MitoQ干预后14天，反应肝脏线粒体功能的其他指标开始恢复时，MitoQ干预组线粒体膜电位下降更显著，说明MitoQ对线粒体膜电位无保护作用，但该推测还有待于后续实验来证实。

值得指出的是，作为临床肝损伤可靠指标的ALT、AST等肝脏氨基转移酶在本研究各组中无统计学差异，Hassan等[22]认为可能与INH给药持续时间有关，将INH给药时间延长至4周时发现，转氨酶水平明显升高。因此，将血清转氨酶水平作为INH肝毒性的判断标准并不可靠。SDH主要分布于肝脏，血清中活性很低，如酶活力升高，强烈提示肝脏损伤。血清SDH在发病1周后可达到峰值，对INH肝损伤评估有一定的参考价值[23]。

综上所述，INH肝毒性的发病机制中无论是毒性代谢产物还是免疫损伤机制的参与，线粒体都可能是其最终的作用靶点，直接阻断线粒体损伤或许能阻止INH肝毒性的发生，而预防性使用抗氧化剂则可有效减轻肝脏损伤。