G6PD缺陷对1,4-苯醌致K562细胞DNA甲基化的影响及其机制

章梦莹，王博深，张 虹，浦跃朴，尹立红，张 娟*

(东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，江苏 南京 210009)

苯是一种无色的有机溶剂，是化学工业中常见的原料和试剂，用于制造塑料、油漆、燃料等，是人类日常生活中广泛接触的一种环境污染物[1-2]。苯主要通过皮肤和呼吸道进入体内，在体内经过代谢，形成酚类和醌类物质，进而在骨髓过氧化物酶催化下生成1,4-苯醌(1,4-benzoquinone，1,4-BQ)[3-4]。苯是明确的致癌物[5]，大量研究表明苯毒性的潜在机制与苯的代谢产物密切相关，具体毒性机制可能与遗传损伤相关，近年来，发现苯也可引起表现遗传学的改变[6]。

DNA甲基化主要通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)进行调控。生物体内的DNMTs 主 要 包 括 ： DNMT1、 DNMT3a、 DNMT3b、DNMT3l及DNMT2。研究表明，DNMT1在DNA甲基化进程中维持甲基化状态[7]，DNMT3a、DNMT3b在生殖细胞发育和早期胚胎发育过程具备从头甲基化作用[8]，DNMT3l通过调控DNMT3a与DNMT3b的表达发挥调节甲基化的作用[9]，而DNMT2对DNA甲基化的作用很小[10]。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症，俗称“蚕豆病”，是一种红细胞溶血性疾病，全球近4亿人患有该疾病[11]。G6PD是催化戊糖磷酸途径中的第一反应的酶，它以NADPH的形式向所有细胞提供还原能力。NADPH使细胞能够抵抗氧化应激，并保留还原形式的谷胱甘肽。由于红细胞不含线粒体，磷酸戊糖途径是其唯一的NADPH来源，因此，防御氧化损伤取决于G6PD[12-13]。

当细胞处于氧化应激的状态下，G6PD一方面促进NADPH的生成，修复超氧化物引起的氧化损伤，另一方面催化还原性谷胱甘肽的合成，使还原型谷胱甘肽与苯的氧化代谢产物结合排出体外，从而减轻苯造成的氧化损伤。因此，G6PD酶活性对苯所致的氧化损伤具有重要的保护作用，已有研究发现，G6PD酶缺陷的人群对于苯毒性的易感性明显增加[14]。

前期研究表明，G6PD缺陷可增加苯醌染毒K562细胞的氧化损伤，进而引起更高程度的遗传损伤[15]。本研究利用已建立的G6PD缺陷细胞模型，探讨G6PD缺陷对1,4-苯醌致K562细胞株DNA甲基化的影响及其机制，为研究G6PD缺陷人群对苯毒性的易感性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

人慢性髓系白血病细胞，购于中国科学院上海细胞库；伊思柯夫改良培养液、PBS和胎牛血清，购于美国Gibco公司；1,4-BQ购于美国Sigma公司；Realtime PCR扩增试剂盒，购于日本TOYOBO公司；引物购于上海捷瑞生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪，购于美国ABI公司；The MethylFlashTMGlobal DNA Methylation ELISA Easy Kit，购于武汉艾美捷科技有限公司；青霉素和链霉素，购于美国Hyclone公司。

1.2 siRNA慢病毒信息

针对G6PD基因构建RNA干扰慢病毒，包括3个RNA干扰靶点及1个阴性对照。4个慢病毒均进行相应的化学修饰及GFP荧光标记，载体信息为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。siRNA序列见表1。阴性对照插入序列为TTCTCCCGAACGTGTC ACGT。

表1 siRNA序列表

1.3 体外构建G6PD缺陷细胞株

通过三质粒包装系统将其包装成慢病毒后感染K562细胞构建G6PD缺陷细胞株和阴性对照细胞(G6PD正常表达细胞)。采用Trizol法提取细胞总RNA。所有样品RNA的D(260)/D(280)比值在1.8~2.0。按照试剂盒进行RNA逆转录，逆转录完成后，用Real-time PCR Master Mix进行荧光定量PCR反应，验证G6PD mRNA表达水平，确认细胞构建是否成功。各基因引物序列见表1。反应体系为10 μL(无酶水2.2 μL，SYBR Green qPCR SuperMix 5 μL，Plus溶液1 μL，浓度为10 μmol/L的目的基因上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL)，qPCR扩增条件为95 ℃、5 min预变性，40个循环扩增(95℃、15 s，60℃、1 min)。每个样品设置3个复孔。采用2-ΔΔCT法计算G6PD mRNA的相对表达水平：ΔCT=CT，目的基因-CT，actin；ΔΔCT=ΔCT，实验组-ΔCT，对照组。

1.4 细胞培养及染毒

将构建成功的G6PD缺陷细胞和G6PD正常表达细胞置于含有10%(体积分数)血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的伊思柯夫改良培养液，37℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱内常规培养。待细胞培养至对数生长期后进行分组处理。G6PD缺陷细胞和G6PD正常表达细胞均分别分为4组：①对照组，不进行染毒处理；②加入终浓度为10 μmol/L的1,4-BQ进行染毒；③加入终浓度为20 μmol/L的1,4-BQ进行染毒；④加入终浓度为1.5 mmol/L的GSH和20 μmol/L的1,4-BQ。各组细胞均于染毒12、24、48 h时收获。

1.5 细胞全基因组DNA甲基化检测

1.5.1 DNA提取 将上述步骤处理过的8组细胞收集至15 mL离心管，1 200 r/min离心5 min，弃上清。向离心管中加入2 mL PBS，1 200 r/min离心5 min，弃去上清。收集的细胞加入20 μL Proteinase K溶液，混匀后加入200 μL缓冲液GB，涡旋混匀，70℃放置10 min。待溶液变清亮，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。加人200 μL无水乙醇，充分振荡混匀15 s。将所得溶液转移至吸附柱。向吸附柱加入500 μL缓冲液GD，离心倒掉废液。向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液。漂洗两遍。将吸附柱置于室温放置数分钟后，将吸附柱转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2~5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。利用紫外分光光度计检测样品DNA浓度及纯度。

1.5.2 DNA甲基化检测 用纯化的DNA甲基化抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗体的微孔中加入样品及标准品。样品孔加入100 ng样品DNA和100 μL结合液。设置6个标准曲线孔，每孔加入100 ng标准品和100 μL结合液，分别含0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%的5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)。对照孔加入100 ng试剂盒提供的阴性样品和100 μL结合液。37℃孵育60 min。用150 μL洗涤液洗涤每个孔5次。向每孔添加100 μL显色液，轻轻摇动平板表面5~10 s，在室温下孵育3~4 min。数分钟后，当含5%5-mC的孔颜色变为深蓝色，每孔加入100 μL停止液。轻轻晃动混合溶液并等待1~2 min以使颜色反应完全停止。于酶标仪450 nm处读取每孔吸光度值D(450)，时间为2~15 min。计算公式如下：

1.6 实时荧光定量PCR检测DNMTs mRNA表达水平

将经过处理过的8组细胞收集至15 mL离心管，1 200 r/min离心5 min，弃上清。向离心管中加入2 mL PBS，1 200 r/min离心5 min，弃去上清，细胞转移至1.5 mL EP管中，细胞总RNA采用Trizol法提取。NanoPhotometer®spectrophotometer检测RNA纯度。所有样品RNA的D(260)/D(280)比值在1.8~2.0。在逆转录为cDNA后，通过SYBR®Green Real time PCR Master Mix-Plus-试剂盒进行扩增，反应体系为10 μL(无酶水 2.2 μL，SYBR Green qPCR SuperMix 5 μL，Plus溶液1 μL，浓度为10 μmol/L的目的基因上、下游引物各0.4 μL)，qPCR扩增条件为95℃、5 min预变性，40个循环扩增(95℃、15 s，60℃、1 min)。每个样品设置3个复孔。采用 2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达水平：ΔCT=CT，目的基因-CT，actin；ΔΔCT=ΔCT，实验组-ΔCT，对照组。引物序列见表2。

表2 基因引物序列

1.7 Western blot检测DNMTs蛋白表达水平

利用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂冰上裂解细胞液，12 000 r/min离心8 min，留取上清。采用BCA方法检测蛋白浓度。选用SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入1∶1 000稀释的一抗(ACTIN、DNMT1和DNMT3a)在4℃下孵育过夜。第二日加入1∶5 000稀释的二抗(HRP标记山羊抗兔二抗)室温孵育1 h，TBST洗涤6次，用显色液曝光，化学发光成像系统捕捉保存，并对蛋白条带的相对表达水平进行分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对结果进行分析。同种细胞的不同剂量组间全基因组甲基化相对水平、DNMTs mRNA表达水平及DNMT1和DNMT3a蛋白表达水平采用单因素方差分析。同一剂量组的G6PD缺陷细胞和G6PD正常细胞的全基因组甲基化相对水平、DNMTs mRNA表达水平及DNMT1和DNMT3a蛋白表达水平的比较采用两独立样本t检验。同一剂量的1,4-BQ不同处理时间组间的DNA甲基化相对水平的比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 G6PD缺陷K562细胞的鉴定

采用荧光定量PCR方法检测K562细胞中G6PD mRNA表达水平，结果见图1，发现G6PD缺陷细胞G6PD mRNA表达水平显著低于对照K562细胞(P<0.05)，说明G6PD缺陷的K562细胞株构建成功。

图1 荧光定量PCR方法检测K562细胞中G6PD mRNA表达水平

2.2 1,4-BQ染毒后K562细胞基因组DNA甲基化水平

1,4-BQ染毒K562细胞24 h时基因组DNA甲基化水平见图2A，可见在未染毒及相同浓度1,4-BQ染毒时，G6PD缺陷细胞基因组DNA甲基化水平均较G6PD正常表达细胞升高(P<0.05)。在1,4-BQ浓度为20 μmol/L时，G6PD正常表达细胞和G6PD缺陷细胞基因组DNA甲基化水平均较相应的未染毒细胞升高(P<0.05)。1,4-BQ染毒不同时间后K562细胞全基因组DNA甲基化相对水平见图2B、C，可见经10 μmol/L 1,4-BQ染毒的48 h内，以及20 μmol/L 1,4-BQ染毒的24 h内，G6PD缺陷细胞的DNA甲基化相对水平均高于G6PD正常表达细胞(P<0.05)。另外，经过20 μmol/L 1,4-BQ染毒48 h时，两种细胞的甲基化相对水平均有所下降，此时G6PD缺陷细胞的全基因组DNA甲基化相对水平低于G6PD正常表达细胞(P<0.05)。

图2 1,4-BQ染毒K562细胞后基因组DNA甲基化水平

2.3 DNMTs mRNA的表达水平

实时荧光定量PCR检测结果见图3，在0、10、20 μmol/L共3种不同剂量1,4-BQ染毒下，除10 μmol/L 1,4-BQ染毒时的DNMT3b mRNA，其他各组中G6PD缺陷细胞DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA的表达水平均高于G6PD正常表达细胞(P<0.05)。在1,4-BQ浓度为20 μmol/L时，G6PD正常表达细胞和G6PD缺陷细胞DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA的表达水平均较相应的未染毒细胞升高(P<0.05)。

图3 实时荧光定量PCR检测K562细胞DNMTs mRNA的表达

2.4 DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平

Western blot检测结果见图4，在0、10、20 μmol/L共3种不同剂量1,4-BQ染毒下，G6PD缺陷细胞的DNMT1和DNMT3a蛋白表达水平均高于G6PD正常表达细胞(P<0.05)。另外，在1,4-BQ浓度为20 μmol/L时，G6PD正常表达细胞和G6PD缺陷细胞DNMT1和DNMT3a蛋白的表达水平均较相应的未染毒细胞升高(P<0.05)。

图4 Western blot检测K562细胞DNMT1、DNMT3a蛋白的表达

2.5 GSH干预对K562细胞全基因组DNA甲基化的影响

为验证GSH的作用，在20 μmol/L 1,4-BQ染毒时，同时在培养液中加入GSH进行干预，检测细胞全基因组DNA甲基化水平，结果图5。20 μmol/L 1,4-BQ染毒后，G6PD缺陷细胞基因组DNA甲基化水平较G6PD正常表达细胞升高(P<0.05)。加入GSH后，两组细胞基因组DNA甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 GSH干预对K562细胞DNMTs mRNA表达水平的影响

图5 GSH干预对K562细胞全基因组DNA甲基化的影响

实时荧光定量PCR检测结果见图6，20 μmol/L的1,4-BQ染毒后，G6PD缺陷细胞DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA表达水平均较G6PD正常表达细胞升高(P<0.05)。加入GSH后，两组细胞DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

图6 实时荧光定量PCR检测GSH干预对DNMTs mRNA表达水平的影响

2.7 GSH干预对K562细胞DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平的影响

Western blot检测结果见图 7，20 μmol/L1,4-BQ染毒后，G6PD缺陷细胞DNMT1及DNMT3a蛋白表达水平均较G6PD正常表达细胞升高(P<0.05)。加入GSH后，两组细胞DNMT1及DNMT3a蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

G6PD是磷酸戊糖途径的限速酶，G6PD缺乏使GSH生成量减少，影响以GSH为中心的抗氧化系统，从而加重机体自身氧化损伤[16]。研究发现，G6PD缺陷细胞的甲基化相对水平高于对照组，原因可能是G6PD缺陷导致GSH减少，使细胞更容易受到外界自由基攻击，使细胞甲基化相对水平进一步上升。

图7 Western blot检测GSH干预对K562细胞DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平的影响

当前，国家化工产业以苯为原材料的生产量大，苯作业工人众多，但由于苯致癌的具体机制仍不清楚，所以寻找有效的生物标志一直是防控职业苯中毒的研究热点[17]。在我国，苯作业工人健康保护和体检筛查首先以外周血象为主，主要依赖于外周血白细胞水平，但目前已有研究发现，相比于苯引起的血象变化，表观遗传具有更为直接和早期的表现[18]。

通过全基因组甲基化分析，发现采用10 μmol/L 1,4-BQ染毒K562细胞时，细胞的甲基化水平在48 h内持续升高(P<0.05)。两种细胞被苯醌处理后，甲基化相对水平均出现了升高。推测细胞因被苯醌处理引发氧化应激，促进自身自由基生成量增大，氧化损伤加重，甲基转移酶的活性改变，进而改变全基因组DNA甲基化的水平。K562细胞在经过20 μmol/L 1,4-BQ染毒后的12~24 h内，甲基化水平相对升高，但在24~48 h内又会有所降低。此现象原因可能是细胞经苯醌染毒24 h后，细胞存活量减少，导致甲基化水平降低。经过1,4-BQ染毒后，G6PD缺陷细胞和G6PD正常细胞的甲基化相对水平差异显著增大(P<0.05)。这是由于G6PD缺陷细胞受到1,4-BQ毒性作用时，G6PD缺陷细胞不能产生足够的抗氧化物质，无法代谢1,4-BQ，使自身更容易受到1,4-BQ的损伤。

由于DNA甲基化相对水平受到DNA甲基转移酶的调控，故本研究进一步检测了G6PD缺陷细胞与正常表达细胞的DNMTs表达水平。研究发现，G6PD缺陷细胞的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达量均高于G6PD正常细胞。1,4-BQ处理后，G6PD缺陷细胞与G6PD正常细胞的DNMTs表达水平的差异显著增大。进一步检测了DNMT1和DNMT3a蛋白的表达水平。结果显示，相比于G6PD正常细胞，G6PD缺陷细胞的DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平更高(P<0.05)。推测G6PD缺陷细胞更容易受到氧化损伤，引起自由基增多，导致甲基化转移酶表达升高，进而甲基化相对水平更高。

为了验证GSH生成不足是导致G6PD缺陷细胞的甲基化相对水平升高重要原因的猜想，本研究在20 μmol/L苯醌染毒细胞的基础上加入GSH进行干预。通过在培养液中加入GSH，G6PD缺陷细胞与对照细胞的DNA甲基化相对水平差异无统计学意义(P>0.05)。表明GSH可以消除G6PD缺陷所致的全基因组DNA甲基化相对水平及DNMTs mRNA表达水平的改变。

同样在1,4-BQ影响下，G6PD缺陷细胞的甲基化相对水平会明显高于正常细胞，由此可见，G6PD缺陷可能以通过抑制GSH合成的方式增加氧化应激水平，最终导致细胞DNMTs生成量的增多以及全基因组DNA甲基化程度的升高。